论文部分内容阅读
研究目的多聚嘧啶区结合蛋白1（Polypyrimidine tract-binding protein 1,PTBP1）被认为是一种重要的转录后基因表达调节因子,可以影响m RNA的剪接、翻译、稳定性以及定位,并且具有多种与RNA新陈代谢相关的分子机制,其中最重要的作用就是对m RNA的选择性剪接产生抑制作用。PTBP1已被证明在调控剪接位点选择中发挥作用,并在哺乳动物细胞中作为选择性剪接调节因子发挥作用。先前已有研究表明:PTBP1在小鼠帕金森和视神经损伤模型中均有神经保护作用。研究者通过敲低该分子成功逆转了两种疾病模型的小鼠的疾病表型,有重要的研究意义。尽管如此,基于该分子的研究目前仍集中于中枢神经系统尤其是脑内,而在外周神经损伤的治疗研究领域,以PTBP1为核心的治疗策略却少有提及,削弱了这一新型靶点的潜在治疗价值。本课题旨在探索PTBP1在外周神经损伤中的具体作用,进而寻找潜在的PTBP1在外周神经损伤修复中的作用及其分子机制,为开发有效的神经损伤保护药物提供理论依据,具有重要的科学意义和潜在的临床应用价值。研究方法1、动物实验:将7-8周雄性C57BL/6小鼠（20 g-30 g）随机分为3组,每组5只,对照组（假手术组）,坐骨神经损伤（Sciatic nerve injury,SNI）组,SNI+AAV-GFAPCas Rx-PTBP1组,采用间断夹闭法夹闭小鼠坐骨神经建立外周神经损伤模型。首先取14 d小鼠脊髓,背根神经节（Dorsal root ganglion,DRG）组织,免疫荧光（Immunofluorescence,IF）技术验证AAV腺相关病毒对PTBP1的敲低水平,取坐骨神经标本进行HE染色观察神经损伤及修复程度。2、细胞实验:首先从胎鼠分离原代星型胶质细胞,在体外培养6-7天后,胰酶消化后种于12孔板,给予小干扰RNA转染星形胶质细胞降低PTBP1表达,通过q-PCR、Western Blot（WB）技术分别从m RNA和蛋白水平检测PTBP1干扰水平。随后,构建细胞敲减模型,以SI-RNA对星形胶质细胞进行转染。通过q-PCR、WB、IF分别从m RNA和蛋白水平检测神经元相关分子及星形胶质细胞极化marker表达水平。通过转录组测序筛选出PTBP1在外周神经损伤修复中的关键分子及信号通路。结果1、对小鼠脊髓与DRG组织进行PTBP1与GFAP免疫荧光共染色显示,PTBP1分子在脊髓与DRG中主要定位于星形胶质细胞中。2、在外周神经损伤模型背景下,取SNI后0 d,3 d,7 d,14 d小鼠脊髓和DRG组织进行PTBP1免疫荧光及WB,结果显示PTBP1在神经损伤后呈现急性期升高后逐渐下降的趋势。3、采用鞘内注射方式给予AAV-GFAP-Cas Rx-PTBP1腺相关病毒后,免疫组化和WB结果显示PTBP1表达降低,证实AAV的敲减效率。4、取SNI+AAV-GFAP-Cas Rx-PTBP1后14 d小鼠坐骨神经组织进行HE染色及Tublin-β3及Tunel免疫荧光检测神经纤维张入、轴突再生及局部凋亡情况,结果显示与SNI组相比,SNI+AAV-GFAP-Cas Rx-PTBP1组小鼠坐骨神经纤维张入及轴突再生得到明显改善,促进了坐骨神经损伤后的修复。5、对照组、SNI组及SNI+AAV-GFAP-Cas Rx-PTBP1组小鼠采用Von Frey及Hot Plate Analgesia test法测定机械痛与热痛阈值,由对照组小鼠得出热痛机械痛基础阈值,结果显示与SNI组相比,SNI+AAV-GFAP-Cas Rx-PTBP1组小鼠热痛阈值下降至基础阈值的时间更短,证明SNI+AAV-GFAP-Cas Rx-PTBP1组小鼠坐骨神经轴突再生速度加快,促进了神经损伤后修复。6、SI-RNA转染星形胶质细胞48h后取样进行转录组测序,结果提示神经元胞体及轴突相关组分增加,早期神经元标志物（Recombinant Doublecortin,DCX）表达上调明显,同时A2型星形胶质细胞标志物S100a10,Clcf1表达上调,A1型星形胶质细胞标志物Fkbp5,Fbln5,Serpiing表达下调,此外,还发现胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell derived neurotrophic factor,GDNF）表达上调。7、SI-RNA转染星形胶质细胞72 h后取样进行WB检测结果显示,神经元标志物DCX,VGLUT1,MAP2表达增多,A2型星形胶质细胞极化标志物S100a10表达增多;q-PCR结果显示,A2型星形胶质细胞标志物S100a10,Clcf1和GDNF表达增多,A1型星形胶质细胞标志物Fkbp5,Fbln5,Serpiing表达减少;免疫荧光结果显示,星形胶质细胞中有神经元出现,并表达DCX、MAP2,Neu N,β-tublin等神经元标志物,同时A2型星形胶质细胞极化标志物S100a10表达增多。8、采用鞘内注射方式给予AAV-GFAP-Cas Rx-PTBP1腺相关病毒后,免疫荧光显示小鼠脊髓中A2型星形胶质细胞极化标志物S100a10表达增多,A1型星形胶质细胞标志物C3表达减少。结论PTBP1通过调控星形胶质细胞转分化为早期神经元并能够发育成有功能的成熟神经元,促进了神经元的轴突生长从而加速了外周神经损伤后的轴突再生与修复,同时PTBP1通过促进星形胶质细胞向A2型即营养型星形胶质细胞极化,增加胶质细胞源性神经营养因子分泌,营养神经元及轴突进一步促进外周神经损伤修复。