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牡丹（PaeoniasuffruticosaAndr.）是原产我国的特有名贵花卉，誉称“国色天香”、“花中之王”。春节催花是牡丹产业主要内容之一，生产中催花不良甚至催花失败的现象常有发生。理解休眠解除调控机理是完善催花技术、解决生产中存在问题的理论基础。现已证明，PsMPT(线粒体磷酸转移子)基因在低温解除牡丹休眠中的能量代谢中发挥了重要作用。阐明PsMPT基因在低温解除休眠中的表达调控机制，对深入理解低温解除休眠的调控机制具有重要意义。本研究拟克隆PsMPT基因启动子，构建其系列缺失表达载体和休眠牡丹花芽酵母杂交文库，为筛选启动子中的低温响应元件、并通过酵母单杂交技术筛选低温调控转录因子，进而为阐明PsMPT基因的调控机制奠定基础。实验选用山东菏泽牡丹基地4年生牡丹品种‘鲁荷红（PaeoniasuffruticosaAndr.LuHeHong）的健壮植株，以CTAB法提取其基因组DNA，通过TAIL-PCR(热不对称交错PCR)技术扩增PsMPT基因启动子，进一步构建系列缺失启动子表达载体，并构建了休眠花芽酵母杂交AD(转录激活结构域)文库。主要实验结果如下:
1.设计了3个特异引物SP1、SP2和SP3，利用TAIL-PCR技术扩增出约1kb的启动子片段。将得到的启动子片段连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌，经PCR和HindⅢ/BamHⅠ双酶切鉴定，证明克隆片段已经插入pMD18-T载体。测定了该克隆片段序列，并进一步根据全长序列设计了上游引物SP4，与下游引物SP1组合验证了克隆的启动子。
2.序列分析表明该启动子片段含有1177个核苷酸。经PLACE和PlantCare分析，发现序列中包含启动子的一般结构TATA-box和CAAT-box，序列分析还发现几个GATA-box，其核心序列为GATA;1个低温响应元件LTRE(lowtemperatureresponsiveelement)，其核心序列为CCGAC。另外，还发现了8个脱水响应元件MYC(双链)，其核心序列为CANNTG(N=A/T/G/C)。MYC调控CBF/DREB1在低温条件下的转录，推测该功能元件可能与低温响应有关。
3.根据启动子分析工具所获得的MYC元件的位置，在得到的启动子序列上游设计5条上游引物，分别与下游的1条共同引物进行PCR扩增，得到含有MYC元件的5个长度不同的片段，片段长度分别为322bp，582bp，726bp,844bp和1176bp。
4.将5个片段连接到pBI121载体替代其中的CaMV35S启动子，构建了系列缺失启动子，为进一步鉴定其中的低温响应元件，进而为筛选调控PsMPT基因表达的转录因子奠定了基础。
5.从低温处理0、7、14、21、28d的牡丹花芽中提取RNA，反转录后利用LD-PCR合成了双链cDNA。经检测，提取的总RNA质量好，无降解现象。
6.经CHROMASPINTMTE-400柱纯化后，重组pGADT7-Rec质粒转化酵母菌株AH109，构建了酵母杂交文库，文库滴度为1.77×106。