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DNA聚合酶δ(DNA Polδ)是最保守的真核生物DNA聚合酶之一。DNA Polδ具有5’-3’聚合酶活性及3’-5’核酸外切酶活性。哺乳动物DNA Polδ由四个分子量分别为125kD、50kD、68kD、12 kD的亚基组成,即p125、p50、p66和p12,其中p125是催化亚基,p50为结合亚基。DNA Polδ在真核细胞DNA复制及损伤修复中起重要作用,且与细胞周期调控、相关疾病发生及细胞转化相关。
本室前期研究表明,DNA Polδ随复制性衰老表达下调。本研究拟构建DNAPolδp50亚基(DNA Polδ2)正义及反义真核表达载体,为了进一步研究DNA Polδ2对复制性衰老的影响及分子机制奠定必要基础。
目的:
构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2,观察其在HEK293细胞中的表达水平。
方法:
1.正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2的构建:(1)根据GenBank的人DNA Polδ2 cDNA序列,设计PCR引物；从WI28细胞中提取总RNA,经RT-PCR方法,扩增目的基因DNA Polδ2片段；(2)PCR产物经回收纯化后,与pMD-18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2；(3)将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2,载体经PCR及测序鉴定。
2.正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2在HEK293细胞中表达:(1)应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照；(2)转染48h后提取各组细胞RNA,用RT-PCR方法检测目的基因mRNA表达水平变化；(3)利用Western Blot方法检测各组细胞目的蛋白表达水平。
结果:
1.通过PCR方法扩增出人DNA Polδ2cDNA全长序列,大小为1410bp,与GeneBank序列相比完全一致,无突变及错译。
2.TA克隆质粒pMD-18T-Polδ2经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,得到约1410bp的片段,该片段经测序,与GeneBank上的DNA Polδ2cDNA序列相比完全一致。
3.正、反向插入的TA克隆质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后得到的目的片段,与真核载体pcDNA3.1(+)成功连接,并从PCR验证的阳性克隆菌落提取到正义和反义的DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2。
4.经基因测序及BLAST同源性分析对比,pcDNA3.1-Polδ2插入片段与DNAPolδ2 cDNA序列完全一致,同源性100％。
5.用脂质体转染法将正义、反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2、空载体pcDNA3.1(+)转染入HKE293细胞48h后,正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2 mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组；与空载体转染组及阴性对照组相比,正义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性。
结论:
人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功。