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药用植物通过在特定器官或组织中产生种类繁多的次生代谢产物以适应瞬息万变的生存环境，这些次生代谢产物如紫杉醇、青蒿素、人参皂苷、丹参酮等在人类疾病治疗中发挥了重要作用。通过解析药用活性化合物生物合成途径，利用合成生物学策略在微生物中重构植物次生代谢途径并进行药用活性化合物的生产，对提高有效成分产量，缓解药用植物资源紧张，促进药用植物资源可持续发展具有重要意义。细胞色素P450酶是植物次生代谢过程中的重要后修饰酶，通过P450的结构修饰一方面产生具有活性的化合物，另一方面为进一步的结构修饰提供基团。药用活性化合物异源合成代谢中，P450常作为调控的重要靶点。利用理性设计和定向进化等方法对P450进行结构改造，能有效提高催化活性，以拓宽其在药用植物有效成分生物合成途径解析和重要的中间体获得方面的应用。本课题组一直致力于丹参酮类化合物生物合成途径中的P450基因功能研究，并已成功克隆并鉴定多个P450参与多步反应并且由于P450催化的杂泛性产生了众多中间体，利用这些基因构建了生产中间体的酵母工程菌，大大推进了丹参酮生物合成和合成生物学研究。随着研究的深入，P450催化效率逐渐成为丹参酮类化合物生物合成的关键组件和优化难点。
前期报道丹参酮生物合成途径中CY76AH亚家族两个P450基因，CYP76AH1和CYP76AH3，均能催化次丹参酮二烯生成铁锈醇，继而催化铁锈醇生成丹参酮类化合物生物合成途径解析的重要中间体，11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚，但二者对不同底物的催化活性具有较大差异。在进一步的酵母工程菌重构11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚的生成途径中，由于导入的两个P450催化活性低、立体/区域选择性差，影响底物利用效率，导致工程菌目标产物产量低。通过定向改造CYP76AH1和CYP76AH3，对其催化效率进行优化，定向整合两个P450为单个催化效率最高的功能整合P450突变体，简化丹参酮生物合成途径中的酶，可以缩短反应过程中底物运输路径，提高底物利用效率，并分别构建高产中间代谢产物11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚的酵母工程菌。主要研究结果如下:
1.CYP76AH1和CYP76AH3候选活性位点分析
(1)实验室前期研究表明，CYP76AH1和CYP76AH3序列高度同源，催化功能一致，但对不同底物的催化活性差异较大。使用SWISS-MODEL工具分别对两个蛋白的三级结构进行预测，最终选择与CYP76AH1序列同源性为24.78％的2hi4.1.A蛋白结构为模板进行同源建模，选择与CYP76AH3序列同源性为27.14.％的6b82.1.B蛋白结构为模板进行同源建模，分别得到CYP76AH1和CYP76AH3的蛋白构象。基于CYP76AH1和CYP76AH3两个蛋白的氨基酸残基数目及其QMEAN的Z值，获得质量较为可信的CYP76AH1蛋白模型和CYP76AH3蛋白模型。
(2)将以上建立的蛋白模型CYP76AH3和CYP76AH1分别与配体次丹参酮二烯、铁锈醇进行分子对接。三维模型的比较分析结果发现CYP76AH3活性位点中的四个氨基酸残基(E301，E306，M395和F479)，对应于CYP76AH1的四个氨基酸残基(D301，S306，I395和V479)，可能与催化次丹参酮二烯和铁锈醇的氧化有关。此外通过比较活性口袋中活性位点与底物次丹参酮二烯、铁锈醇及铁血红素结合的活性氧原子之间的距离，发现301、306、395、479位不同的氨基酸残基有较大差别，将这四个氨基酸残基作为候选活性位点进行结构改造研究。
2.CYP76AH1和CYP76AH3突变体体外功能研究
(1)将4个候选位点进行组合突变共构建了30个突变载体并进行真核表达，以次丹参酮二烯为底物，进行体外酶促。结果显示，同野生型CYP76AH1和CYP76AH3蛋白连续催化产物生成量相比，共有5个突变体催化11-羟基铁锈醇生成的量显著增高，7个突变体催11-羟基柳杉酚生成的量显著增高，16个突变体催化11-羟基柳杉酚生成的量显著增高。其中催化柳杉酚生成量最高的突变体为:CYP76AH3E301D,E306S;催化11-羟基铁锈醇、11-羟基柳杉酚生成量最高的突变体为:CYP76AH1D301E,V479F。
(2)根据酶促反应结果推测，CYP76AH3的301位谷氨酸和479位苯丙氨酸是决定催化次丹参酮二烯产生11-羟基铁锈醇和11-羟基柳杉酚的催化效率的关键位点。CYP76AH1的301位天冬氨酸和306位丝氨酸是决定连续催化次丹参酮二烯产生柳杉酚催化效率的关键位点。
3.高产目标产物酵母工程菌的构建
(1)将11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚生成量增高的突变体与丹参P450还原酶SmCPR1共同转化生产次丹参酮二烯的酵母菌株YJ14，获得高产11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚的酵母工程菌。进行摇瓶发酵。相较于野生型，不同突变体中，11-羟基铁锈醇生成量提高了14.16-22.57倍，11-羟基柳杉酚生成量提高了10.49-28.37倍，柳杉酚生成量提高了11.11-40.29倍。最终YJ14-CPR1-CYP76AH1D301E,V479F突变体工程菌11-羟基铁锈醇的产量为6.01mg·L-1，11-羟基柳杉酚产量为5.31mg·L-1，YJ14-CPR1-CYP76AH3E301D，E306S突变体工程菌柳杉酚产量为1.64mg·L-1。
(2)在72h内考察了YJ51、YJ14-CPR1-CYP76AH1D301E,V479F和YJ14-CPR1-CYP76AH3E301D,E306S的OD600值、以及次丹参酮二烯、铁锈醇、11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚产量的变化。结果表明，突变体酵母工程菌的生长情况并未受到影响。在发酵24h内，相较于突变体工程菌，YJ51中次丹参酮二烯几乎不积累，但铁锈醇有明显的积累。而突变体工程菌在发酵72h内铁锈醇的积累显著下降，同时11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚的产量有显著提升。在发酵24h后，YJ14-CPR1-CYP76AH1D301E,V479F突变体工程菌中11-羟基铁锈醇产量达到最高，此时没有检测到柳杉酚的生成，说明经优化的YJ14-CPR1-CYP76AH1D301E,V479F突变体工程菌在减少前体铁锈醇积累的同时抑制柳杉酚的底物竞争从而使11-羟基铁锈醇产量达到最高。柳杉酚在YJ14-CPR1-CYP76AH3E301D,E306S突变体工程菌中的产量最高。
本研究通过定向改造对丹参酮生物合成途径两个已知功能的P450蛋白CYP76AH1和CYP76AH3进行催化效率优化研究;通过同源建模和分子对接分析获得候选突变位点，构建了组合突变体库;并进行真核表达及体外酶促反应进行活性比较分析，最终成功获得针对不同产物的功能整合的高效P450突变体。将定向改造的突变体与丹参的P450还原酶共转化次丹参酮二烯基因工程菌，分别获得了高产11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚的酵母工程菌。本研究利用定向进化的方法，通过定向改造对CYP76AH1和CYP76AH3催化效率进行了优化和通过简化酶平台，缩短反应过程中底物运输路径，提高底物利用效率，重构代谢途径，为后续丹参酮生物合成途径解析提供丰富的底物及底盘菌，对萜类化合物生物合成途径解析及合成生物学研究具有示范作用。
前期报道丹参酮生物合成途径中CY76AH亚家族两个P450基因，CYP76AH1和CYP76AH3，均能催化次丹参酮二烯生成铁锈醇，继而催化铁锈醇生成丹参酮类化合物生物合成途径解析的重要中间体，11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚，但二者对不同底物的催化活性具有较大差异。在进一步的酵母工程菌重构11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚的生成途径中，由于导入的两个P450催化活性低、立体/区域选择性差，影响底物利用效率，导致工程菌目标产物产量低。通过定向改造CYP76AH1和CYP76AH3，对其催化效率进行优化，定向整合两个P450为单个催化效率最高的功能整合P450突变体，简化丹参酮生物合成途径中的酶，可以缩短反应过程中底物运输路径，提高底物利用效率，并分别构建高产中间代谢产物11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚的酵母工程菌。主要研究结果如下:
1.CYP76AH1和CYP76AH3候选活性位点分析
(1)实验室前期研究表明，CYP76AH1和CYP76AH3序列高度同源，催化功能一致，但对不同底物的催化活性差异较大。使用SWISS-MODEL工具分别对两个蛋白的三级结构进行预测，最终选择与CYP76AH1序列同源性为24.78％的2hi4.1.A蛋白结构为模板进行同源建模，选择与CYP76AH3序列同源性为27.14.％的6b82.1.B蛋白结构为模板进行同源建模，分别得到CYP76AH1和CYP76AH3的蛋白构象。基于CYP76AH1和CYP76AH3两个蛋白的氨基酸残基数目及其QMEAN的Z值，获得质量较为可信的CYP76AH1蛋白模型和CYP76AH3蛋白模型。
(2)将以上建立的蛋白模型CYP76AH3和CYP76AH1分别与配体次丹参酮二烯、铁锈醇进行分子对接。三维模型的比较分析结果发现CYP76AH3活性位点中的四个氨基酸残基(E301，E306，M395和F479)，对应于CYP76AH1的四个氨基酸残基(D301，S306，I395和V479)，可能与催化次丹参酮二烯和铁锈醇的氧化有关。此外通过比较活性口袋中活性位点与底物次丹参酮二烯、铁锈醇及铁血红素结合的活性氧原子之间的距离，发现301、306、395、479位不同的氨基酸残基有较大差别，将这四个氨基酸残基作为候选活性位点进行结构改造研究。
2.CYP76AH1和CYP76AH3突变体体外功能研究
(1)将4个候选位点进行组合突变共构建了30个突变载体并进行真核表达，以次丹参酮二烯为底物，进行体外酶促。结果显示，同野生型CYP76AH1和CYP76AH3蛋白连续催化产物生成量相比，共有5个突变体催化11-羟基铁锈醇生成的量显著增高，7个突变体催11-羟基柳杉酚生成的量显著增高，16个突变体催化11-羟基柳杉酚生成的量显著增高。其中催化柳杉酚生成量最高的突变体为:CYP76AH3E301D,E306S;催化11-羟基铁锈醇、11-羟基柳杉酚生成量最高的突变体为:CYP76AH1D301E,V479F。
(2)根据酶促反应结果推测，CYP76AH3的301位谷氨酸和479位苯丙氨酸是决定催化次丹参酮二烯产生11-羟基铁锈醇和11-羟基柳杉酚的催化效率的关键位点。CYP76AH1的301位天冬氨酸和306位丝氨酸是决定连续催化次丹参酮二烯产生柳杉酚催化效率的关键位点。
3.高产目标产物酵母工程菌的构建
(1)将11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚生成量增高的突变体与丹参P450还原酶SmCPR1共同转化生产次丹参酮二烯的酵母菌株YJ14，获得高产11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚的酵母工程菌。进行摇瓶发酵。相较于野生型，不同突变体中，11-羟基铁锈醇生成量提高了14.16-22.57倍，11-羟基柳杉酚生成量提高了10.49-28.37倍，柳杉酚生成量提高了11.11-40.29倍。最终YJ14-CPR1-CYP76AH1D301E,V479F突变体工程菌11-羟基铁锈醇的产量为6.01mg·L-1，11-羟基柳杉酚产量为5.31mg·L-1，YJ14-CPR1-CYP76AH3E301D，E306S突变体工程菌柳杉酚产量为1.64mg·L-1。
(2)在72h内考察了YJ51、YJ14-CPR1-CYP76AH1D301E,V479F和YJ14-CPR1-CYP76AH3E301D,E306S的OD600值、以及次丹参酮二烯、铁锈醇、11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚产量的变化。结果表明，突变体酵母工程菌的生长情况并未受到影响。在发酵24h内，相较于突变体工程菌，YJ51中次丹参酮二烯几乎不积累，但铁锈醇有明显的积累。而突变体工程菌在发酵72h内铁锈醇的积累显著下降，同时11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚的产量有显著提升。在发酵24h后，YJ14-CPR1-CYP76AH1D301E,V479F突变体工程菌中11-羟基铁锈醇产量达到最高，此时没有检测到柳杉酚的生成，说明经优化的YJ14-CPR1-CYP76AH1D301E,V479F突变体工程菌在减少前体铁锈醇积累的同时抑制柳杉酚的底物竞争从而使11-羟基铁锈醇产量达到最高。柳杉酚在YJ14-CPR1-CYP76AH3E301D,E306S突变体工程菌中的产量最高。
本研究通过定向改造对丹参酮生物合成途径两个已知功能的P450蛋白CYP76AH1和CYP76AH3进行催化效率优化研究;通过同源建模和分子对接分析获得候选突变位点，构建了组合突变体库;并进行真核表达及体外酶促反应进行活性比较分析，最终成功获得针对不同产物的功能整合的高效P450突变体。将定向改造的突变体与丹参的P450还原酶共转化次丹参酮二烯基因工程菌，分别获得了高产11-羟基铁锈醇、柳杉酚和11-羟基柳杉酚的酵母工程菌。本研究利用定向进化的方法，通过定向改造对CYP76AH1和CYP76AH3催化效率进行了优化和通过简化酶平台，缩短反应过程中底物运输路径，提高底物利用效率，重构代谢途径，为后续丹参酮生物合成途径解析提供丰富的底物及底盘菌，对萜类化合物生物合成途径解析及合成生物学研究具有示范作用。