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麻花艽为龙胆科龙胆属秦艽组多年生草本植物,为青藏高原特有种,是一种传统中藏药材,具有较高的药用价值。本论文以麻花艽药用部位根部为研究对象,利用近红外光谱技术对其红外光谱特征进行了分析,建立了麻花艽近红外光谱基础数据库,通过将近红外光谱技术与高效液相色谱技术相结合,借助化学计量方法分别建立环烯醚萜苷活性成分龙胆苦苷、马钱苷酸及二者总量的定量检测模型。通过该工作的开展,可对麻花艽中活性成分含量进行快速检测,为麻花艽原药材质量控制提供一种快速、准确的检测方法。取得的主要研究结果如下:
1.利用正交试验,优化得到近红外光谱采集条件为分辨率8cm-1,扫描次数64次,装样厚度0.1cm,方法学实验表明该方法具有良好的精确性、重复性和稳定性。对样品的近红外光谱进行分析发现,麻花艽特征吸收峰共有7个,分别为8332cm-1、6842cm-1、5789cm-1、5176cm-1、4737cm-1、4331cm-1、4258cm-1,不同产地7个特征峰的吸光度RSD均大于8.00%,说明不同产地样品间的吸收差距较大。以吸收个数缺失率小于5.00%为标准,得到5个共有峰,分别为6842cm-1、5789cm-1、5176cm-1、4737cm-1、4258cm-1。
2.利用高效液相色谱HPLC法对麻花艽中两种环烯醚萜苷活性成分龙胆苦苷和马钱苷酸含量进行了测定。经单因素试验,得到龙胆苦苷和马钱苷酸的提取条件为:提取浓度40%甲醇,提取时间30min,料液比3.75mg/mL(0.0300g/8mL)。经单因素试验,得到色谱条件为:色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C8(4.6×250mm,5μm);流动相为5%乙腈(含2.5mmol/L甲酸)-95%乙腈,流速为1.0mL/min;进样量10μL;柱温25℃。对HPLC条件进行方法学验证,精密度试验、重复性试验、稳定性试验RSD均小于5%,龙胆苦苷的加标回收率101.72%,马钱苷酸的加标回收率为108.69%,表明该方法具有较好的精确性、重复性、稳定性。
3.利用正交试验对龙胆苦苷和马钱苷酸的近红外定量建模方法进行优化,最终建模条件为:①、龙胆苦苷成分建模利用PLS方法,谱图数据经SNV处理,光谱预处理为D2+Norris(5,5),建模波段为8826-4188cm-1,建模因子9。六个模型参数RMSEC、RMSEP、RMSECV、Rcal、Rval、Rcv分别为0.0037、0.0036、0.0041、0.9398、0.9478、0.9238,说明模型效果良好。②、马钱苷酸成分建模条件为PLS方法,谱图数据不经处理,光谱预处理为D1+Norris(5,5),建模波段为7214-4638cm-1,建模因子10。六个模型参数RMSEC、RMSEP、RMSECV、Rcal、Rval、Rcv分别为0.0030、0.0034、0.0036、0.8476、0.7227、0.7710,说明模型效果良好。③、二者总量模型的建模条件为PLS方法,谱图数据不经处理,光谱预处理为D1+Norris(5,5),建模波段为7124-4074cm-1,建模因子8。六个模型参数RMSEC、RMSEP、RMSECV、Rcal、Rval、Rcv分别为0.0054、0.0062、0.0059、0.9132、0.8887、0.8952。3个模型建模数据的实际值与预测值线性关系良好,相差较小,说明模型效果良好。
4.分别利用龙胆苦苷及马钱苷酸近红外定量检测模型对未知含量麻花艽样品进行预测,以723份麻花艽样品为计,龙胆苦苷整体平均含量为4.33%,马钱苷酸整体平均含量为0.93%。分别利用SGA(龙胆苦苷及马钱苷酸模型和)及MT(龙胆苦苷及马钱苷酸总量模型)模型预测麻花艽中龙胆苦苷及马钱苷酸的总量,两种计算方法所得龙胆苦苷及马钱苷酸总量相差不大。MT模型计算所得龙胆苦苷及马钱苷酸总量均值为5.25%,有98.06%的样品含量达到入药要求,符合2015版《药典》入药标准;SGA模型计算所得龙胆苦苷及马钱苷酸总量均值为5.28%,有97.65%的样品含量达到入药要求,符合2015版《药典》入药标准。结合两种模型效果的比较结果,使用SGA模型进行麻花艽品质分析时结果更准确,有97.65%的样品符合2015版《药典》中麻花艽药材入药的标准,所建模型准确可靠。
1.利用正交试验,优化得到近红外光谱采集条件为分辨率8cm-1,扫描次数64次,装样厚度0.1cm,方法学实验表明该方法具有良好的精确性、重复性和稳定性。对样品的近红外光谱进行分析发现,麻花艽特征吸收峰共有7个,分别为8332cm-1、6842cm-1、5789cm-1、5176cm-1、4737cm-1、4331cm-1、4258cm-1,不同产地7个特征峰的吸光度RSD均大于8.00%,说明不同产地样品间的吸收差距较大。以吸收个数缺失率小于5.00%为标准,得到5个共有峰,分别为6842cm-1、5789cm-1、5176cm-1、4737cm-1、4258cm-1。
2.利用高效液相色谱HPLC法对麻花艽中两种环烯醚萜苷活性成分龙胆苦苷和马钱苷酸含量进行了测定。经单因素试验,得到龙胆苦苷和马钱苷酸的提取条件为:提取浓度40%甲醇,提取时间30min,料液比3.75mg/mL(0.0300g/8mL)。经单因素试验,得到色谱条件为:色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C8(4.6×250mm,5μm);流动相为5%乙腈(含2.5mmol/L甲酸)-95%乙腈,流速为1.0mL/min;进样量10μL;柱温25℃。对HPLC条件进行方法学验证,精密度试验、重复性试验、稳定性试验RSD均小于5%,龙胆苦苷的加标回收率101.72%,马钱苷酸的加标回收率为108.69%,表明该方法具有较好的精确性、重复性、稳定性。
3.利用正交试验对龙胆苦苷和马钱苷酸的近红外定量建模方法进行优化,最终建模条件为:①、龙胆苦苷成分建模利用PLS方法,谱图数据经SNV处理,光谱预处理为D2+Norris(5,5),建模波段为8826-4188cm-1,建模因子9。六个模型参数RMSEC、RMSEP、RMSECV、Rcal、Rval、Rcv分别为0.0037、0.0036、0.0041、0.9398、0.9478、0.9238,说明模型效果良好。②、马钱苷酸成分建模条件为PLS方法,谱图数据不经处理,光谱预处理为D1+Norris(5,5),建模波段为7214-4638cm-1,建模因子10。六个模型参数RMSEC、RMSEP、RMSECV、Rcal、Rval、Rcv分别为0.0030、0.0034、0.0036、0.8476、0.7227、0.7710,说明模型效果良好。③、二者总量模型的建模条件为PLS方法,谱图数据不经处理,光谱预处理为D1+Norris(5,5),建模波段为7124-4074cm-1,建模因子8。六个模型参数RMSEC、RMSEP、RMSECV、Rcal、Rval、Rcv分别为0.0054、0.0062、0.0059、0.9132、0.8887、0.8952。3个模型建模数据的实际值与预测值线性关系良好,相差较小,说明模型效果良好。
4.分别利用龙胆苦苷及马钱苷酸近红外定量检测模型对未知含量麻花艽样品进行预测,以723份麻花艽样品为计,龙胆苦苷整体平均含量为4.33%,马钱苷酸整体平均含量为0.93%。分别利用SGA(龙胆苦苷及马钱苷酸模型和)及MT(龙胆苦苷及马钱苷酸总量模型)模型预测麻花艽中龙胆苦苷及马钱苷酸的总量,两种计算方法所得龙胆苦苷及马钱苷酸总量相差不大。MT模型计算所得龙胆苦苷及马钱苷酸总量均值为5.25%,有98.06%的样品含量达到入药要求,符合2015版《药典》入药标准;SGA模型计算所得龙胆苦苷及马钱苷酸总量均值为5.28%,有97.65%的样品含量达到入药要求,符合2015版《药典》入药标准。结合两种模型效果的比较结果,使用SGA模型进行麻花艽品质分析时结果更准确,有97.65%的样品符合2015版《药典》中麻花艽药材入药的标准,所建模型准确可靠。