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由于肿瘤细胞对现有化疗药物的抗药性，严重制约了化疗效果。因此，寻找对胶质瘤有效治疗作用的化合物成为了胶质瘤治疗的一个重要的方向。乌索烷型五环三萜类衍生物已被证明对各种肿瘤具有良好的抗癌活性。然而，此类衍生物对多形性胶质母细胞瘤(GBM)的抗癌作用，以及潜在的作用机制尚不完全清楚。在本研究中，我们从RosacymosaTratt根中分离出14种ursane型三萜类衍生物，并检测了其在已建立的四种替莫唑胺耐药的GBM细胞系中的抗肿瘤活性。基于细胞活力分析，我们评估了这14种化合物的结构-活性构效关系关系(SAR)，发现12号化合物(C-12)表现出最强的抗胶质瘤活性，并证实了C-12的促凋亡作应，随后的机制实验证明C-12促发了Drp1依赖的线粒体溶解和凋亡通路的活化，其深入的作用机制可能与Mia40的减弱，以及线粒体膜间隙转运通路的阻断相关。
材料与方法
14个乌索烷型化合物取自深圳市神经外科学重点实验活性天然产物化合物库，由北京协和医学院药用植物研究所分离提取，纯度>98%。四种胶质瘤细胞系耐药株由本实验室构建，细胞经由96板培养，不同浓度的化合物共孵育处理，采用CCK-8法检测细胞活力，AnnexinV/PI染色的流式细胞检测、TUNEL染色和Caspase-3凋亡检测法检测细胞凋亡状态。采用蛋白质印记实验、免疫共沉淀实验、细胞转染实验和计算机分子模拟实验，检测和发现了线粒体氧化还原酶Mia40相关细胞信号通路的基因表达情况及相应分子之间作用。实验数据均采用SPSS19统计软件进行数据分析处理，所有定量实验至少重复检测3次，图中数据为平均值±标准差(mean±SEM)。当方差系数与假设相同时，将多组实验汇集起来，采用单因素方差分析和t检验来评估多组之间的显著性差异，随后进行Bonferroni校正检验。P＜0.05被认为具有统计学意义。
结果
抗肿瘤活性检测筛选：用不同浓度测试化合物处理48小时后的活力，总结生长抑制的半数抑制浓度(IC50)值以评价抗神经胶质瘤活性。我们评估了14种测试化合物在四种建立的TMZ抗性细胞系中的抗胶质瘤活性，大多数测试化合物显示剂量依赖性活性，其中五个表现出更好的抑制作用(化合物3、4和7，IC50值＜50μM，化合物11和12，IC50值＜20μM)。与这些天然存在的化合物和合成的抗癌剂相比，化合物12在多种细胞系中表现出最强的抗增殖活性。
结构-活性关系分析：本研究结果提供了关于该植物的ursane型衍生物的初始结构-活性关系(SAR)的数据，鉴定了A环部分的C-2或C-3处的缺电子部分对于天然产物家族中的抗癌活性至关重要。
药理活性：C-12引起Caspase-3活性的显著增加，触发了Drp1介导的线粒体溶解，引发TR/U118和TR/U87GBM细胞中的线粒体功能障碍和促凋亡信号的活化。Mia40可能是乌索烷型五环三萜类衍生物的潜在作用靶点，通过阻断MIA途径促进线粒体凋亡信号传导。
对接分析：使用Autodock工具(ADT)进行自动对接模拟对以评估C-12与Mia40蛋白可能的结合取向和构象。对于对接研究结果，Mia40的活性CPC(Cys53-Pro54-Cys55)氧化还原位点被认为是Mia40的六个保守半胱氨酸残基(-CPC-CX9C-CX9C-),因为CPC基序参与形成对底物蛋白质折叠至关重要的混合二硫键结合中间体。
结论
本研究首先测定了ursane型三萜类衍生物在TMZ耐药性GBM细胞中的毒性和促凋亡作用，并评估了活性构效关系。此外，我们通过深入的机制实验，证明了C-12通过特异性阻断Mia40蛋白，干扰线粒体膜间隙的蛋白转运，引发Drp1依赖性线粒体溶解，以及诱导细胞凋亡的作用机制。尽管对体外和体内分子机制的深入理解还有待进一步探索，但是pomonic酸衍生物可能被认为是恶性胶质瘤化疗的主要化合物，同时也鼓励结构修饰研究获得额外的有价值的类似物。
材料与方法
14个乌索烷型化合物取自深圳市神经外科学重点实验活性天然产物化合物库，由北京协和医学院药用植物研究所分离提取，纯度>98%。四种胶质瘤细胞系耐药株由本实验室构建，细胞经由96板培养，不同浓度的化合物共孵育处理，采用CCK-8法检测细胞活力，AnnexinV/PI染色的流式细胞检测、TUNEL染色和Caspase-3凋亡检测法检测细胞凋亡状态。采用蛋白质印记实验、免疫共沉淀实验、细胞转染实验和计算机分子模拟实验，检测和发现了线粒体氧化还原酶Mia40相关细胞信号通路的基因表达情况及相应分子之间作用。实验数据均采用SPSS19统计软件进行数据分析处理，所有定量实验至少重复检测3次，图中数据为平均值±标准差(mean±SEM)。当方差系数与假设相同时，将多组实验汇集起来，采用单因素方差分析和t检验来评估多组之间的显著性差异，随后进行Bonferroni校正检验。P＜0.05被认为具有统计学意义。
结果
抗肿瘤活性检测筛选：用不同浓度测试化合物处理48小时后的活力，总结生长抑制的半数抑制浓度(IC50)值以评价抗神经胶质瘤活性。我们评估了14种测试化合物在四种建立的TMZ抗性细胞系中的抗胶质瘤活性，大多数测试化合物显示剂量依赖性活性，其中五个表现出更好的抑制作用(化合物3、4和7，IC50值＜50μM，化合物11和12，IC50值＜20μM)。与这些天然存在的化合物和合成的抗癌剂相比，化合物12在多种细胞系中表现出最强的抗增殖活性。
结构-活性关系分析：本研究结果提供了关于该植物的ursane型衍生物的初始结构-活性关系(SAR)的数据，鉴定了A环部分的C-2或C-3处的缺电子部分对于天然产物家族中的抗癌活性至关重要。
药理活性：C-12引起Caspase-3活性的显著增加，触发了Drp1介导的线粒体溶解，引发TR/U118和TR/U87GBM细胞中的线粒体功能障碍和促凋亡信号的活化。Mia40可能是乌索烷型五环三萜类衍生物的潜在作用靶点，通过阻断MIA途径促进线粒体凋亡信号传导。
对接分析：使用Autodock工具(ADT)进行自动对接模拟对以评估C-12与Mia40蛋白可能的结合取向和构象。对于对接研究结果，Mia40的活性CPC(Cys53-Pro54-Cys55)氧化还原位点被认为是Mia40的六个保守半胱氨酸残基(-CPC-CX9C-CX9C-),因为CPC基序参与形成对底物蛋白质折叠至关重要的混合二硫键结合中间体。
结论
本研究首先测定了ursane型三萜类衍生物在TMZ耐药性GBM细胞中的毒性和促凋亡作用，并评估了活性构效关系。此外，我们通过深入的机制实验，证明了C-12通过特异性阻断Mia40蛋白，干扰线粒体膜间隙的蛋白转运，引发Drp1依赖性线粒体溶解，以及诱导细胞凋亡的作用机制。尽管对体外和体内分子机制的深入理解还有待进一步探索，但是pomonic酸衍生物可能被认为是恶性胶质瘤化疗的主要化合物，同时也鼓励结构修饰研究获得额外的有价值的类似物。