论文部分内容阅读
重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是指自身抗体与补体的局部沉积相结合导致突触后膜乙酰胆碱受体数量减少和运动终板破坏，从而损害神经肌肉传递的获得性自身免疫性疾病，其主要特征是骨骼肌无力和易疲劳，严重时累及呼吸肌可导致窒息死亡。绝大多数MG患者需长期服用免疫抑制药物，由此带来了各种难以控制的副作用，因此选择合适治疗MG的药物是目前临床用药的重点和难点。
近年来，国内外已有许多学者正积极探索MG的治疗药物，免疫球蛋白(immune globulin)作为一种传统的免疫调节药物已被广泛应用于感染性和自身免疫性疾病的治疗。在MG方面主要采用静脉免疫球蛋白(intravenous immunogloblin ， IVIg )治疗难治性MG和肌无力危象。皮下免疫球蛋白(Subcutaneous immunoglobulin，SCIg)作为目前热门的新型免疫疗法，可替代其他免疫抑制药物应用于慢性自身免疫性疾病，但运用于重症肌无力保护治疗研究，目前还处于临床研究阶段。本实验将SCIg应用到小鼠实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)模型中，观察SCIg对EAMG的治疗作用，为SCIg的临床应用提供实验依据。
目的：
建立EAMG小鼠模型，以此为研究对象，通过观察SCIg对EAMG小鼠血清中AChR-Ab滴度、IgG水平、外周血血细胞计数、中性粒细胞/淋巴细胞比值(NLR)及肌肉组织中肌纤维和线粒体超微结构的影响，来评估SCIg的疗效，探讨SCIg治疗MG的作用机制，为临床运用SCIg治疗重症肌无力提供实验依据。
方法：
1.应用鼠源性AChR-α亚基97-116肽段建立EAMG小鼠模型
通过使用人工合成的鼠源性AChR-α亚基97-116肽段，主动免疫C57BL/6小鼠来建立实验动物模型。将50只健康SPF级雌性C57BL/6小鼠(年龄6w-7w)，体重(18g-20g)随机分为正常组和模型组。在模型组小鼠背部取两点及双足垫部位皮下注射含50μg鼠源性AChR-α亚基97-116肽段的乳剂200μL，正常组小鼠在相同位置给予200μL的佐剂与PBS的混合乳剂。初次免疫后第4周、第8周及第12周分别于背部两点及左右大腿给予同等剂量来进行第二次、第三次、第四次的加强免疫。初次免疫后第13周通过肌力评分和悬挂实验综合评价小鼠肌力情况；ELISA法检测小鼠血清中AChR-Ab水平；新斯的明实验检测小鼠行为学变化以及肌电图检测肌力等综合评价模型是否成功。
2.SCIg对EAMG小鼠的治疗作用及机制研究
将最终纳入EAMG标准的小鼠分为EAMG组、泼尼松组、SCIg高剂量组、SCIg低剂量组。泼尼松组给予泼尼松9mg/kg·d灌胃；SCIg组采取皮下注射SCIg给药2周，每周注射2次，每次间隔2天，第一周SCIg高剂量和SCIg低剂量组都给予2.25g/kg皮下注射，第二周SCIg高剂量组给予4.5g/kg皮下注射，SCIg低剂量组给予2.25g/kg皮下注射，每次注射部位包括背部、大腿或臀部，并适当保持距离；正常组及EAMG组每日给予生理盐水0.2mL灌胃。给药两周后，通过ELISA法分析血清中AChR-Ab和IgG浓度、血细胞分析仪检测小鼠外周血血细胞计数，计算中性粒细胞/淋巴细胞比值(NLR)以及电镜观察肌纤维和线粒体超微结构来评估SCIg疗效，探讨治疗机制。
结果：
1.成功建立实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)小鼠模型
造模45只小鼠中成功的EAMG小鼠18只。EAMG小鼠体重下降、运动迟缓，毛发无光泽，抓力下降。正常组小鼠活动正常，毛发光泽，抓力正常。EAMG小鼠肌力评分(1.11±0.10)与正常组小鼠(0.00±0.00)相比显著升高(P＜0.01)；EAMG小鼠悬挂时间(129.50±7.91s)与正常组小鼠(349.60±8.91s)相比显著下降(P＜0.01)；EAMG小鼠血清AChR-Ab水平(0.52±0.03)与正常组小鼠(0.13±0.01)相比显著升高(P＜0.01)；随机挑选的模型组小鼠在新斯的明实验及肌电图实验中结果为阳性。
2.SCIg对EAMG小鼠治疗作用及机制研究
2.1Lennon评分变化：与EAMG组相比，SCIg高剂量组(0.70±0.12，P＜0.01)，SCIg低剂量组(0.80±0.12，P＜0.01)，泼尼松组(0.63±0.13，P＜0.01)的Lennon评分明显低于EAMG组(1.63±0.13)。与正常组Lennon评分(0.00±0.00)相比，EAMG组(1.63±0.13)的Lennon评分显著增加(P＜0.01)。SCIg高剂量组Lennon评分与SCIg低剂量组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。泼尼松组与SCIg高、低剂量组Lennon评分比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.2AChR-Ab水平的变化：与EAMG组相比，SCIg高剂量组(0.17±0.03，P＜0.01)、SCIg低剂量组(0.22±0.03，P＜0.05)和泼尼松组(0.13±0.03，P＜0.01)的AChR-Ab水平明显低于EAMG组(0.39±0.05)。与正常组AChR-Ab水平(0.12±0.02)相比，EAMG组(0.39±0.05)的AChR-Ab水平显著增加(P＜0.01)。SCIg高剂量组AChR-Ab水平与SCIg低剂量组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。泼尼松组与SCIg高、低剂量组AChR-Ab水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.3IgG浓度的变化：与EAMG组相比，SCIg高剂量组(23.51±2.65mg/mL，P＜0.05)和泼尼松组(16.15±4.26mg/mL，P＜0.05)的IgG浓度明显低于EAMG组(37.20±5.56mg/mL)，SCIg低剂量组(29.49±0.54mg/mL)与EAMG组相比有下降趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。与正常组IgG浓度(17.13±2.01mg/mL)相比，EAMG组IgG浓度(37.20±5.56mg/mL)显著升高(P＜0.01)。SCIg高剂量组IgG浓度与SCIg低剂量组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。泼尼松组与SCIg高、低剂量组IgG浓度比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.4血细胞计数的变化：白细胞计数：与EAMG组白细胞计数(4.50±0.41)×109/L相比，泼尼松组(2.69±0.60)×109/L的白细胞计数降低(P＜0.05)。淋巴细胞计数：与EAMG组淋巴细胞计数(2.02±0.16)×109/L相比，泼尼松组(1.13±0.28)×109/L淋巴细胞计数降低(P＜0.05)。与正常组淋巴细胞数量(9.69±0.53)×109/L相比，EAMG组淋巴细胞数量(2.02±0.16)×109/L降低(P＜0.05)。中性粒细胞计数：泼尼松组(1.15±0.25)×109/L和SCIg高剂量组(1.46±0.13)×109/L的中性粒细胞计数低于EAMG组(3.11±0.67)×109/L(P＜0.05)，SCIg低剂量组(1.60±0.25)×109/L的中性粒细胞计数与EAMG组相比无统计学意义(P＞0.05)。与正常组中性粒细胞计数(0.67±0.12)×109/L相比，EAMG组(3.11±0.67)×109/L显著升高(P＜0.01)。
2.5中性粒细胞/淋巴细胞比值(NLR )的变化：与EAMG组NLR比值(1.56±0.36)相比，SCIg高剂量组NLR比值(0.60±0.13)降低(P＜0.05)，泼尼松组(1.06±0.08)、SCIg低剂量组(0.90±0.23)NLR比值无统计学意义(P＞0.05)。与正常组小鼠NLR比值(0.183±0.024)相比，EAMG组小鼠NLR比值(1.56±0.36)显著增加(P＜0.01)。与泼尼松组相比，SCIg高剂量组NLR比值(0.60±0.13)降低(P＜0.05)，SCIg低剂量组NLR比值(0.90±0.23)无统计学意义(P＞0.05)。SCIg高剂量组NLR比值与SCIg低剂量组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.6肌纤维及线粒体超微结构的变化：电镜检测正常组小鼠肌纤维及线粒体超微结构正常，EAMG组存在肌纤维稀疏、紊乱，线粒体减少、出现云絮状病变及空泡化等超微结构改变，泼尼松组存在肌纤维紊乱，线粒体空泡化，SCIg高、低剂量组能够改善上述病理改变。
结论：
通过人工合成的鼠源性AChR-ɑ亚基97-116肽段可成功建立EAMG小鼠模型。和泼尼松组改善EAMG小鼠症状情况相似，SCIg能降低EAMG小鼠的肌力评分、缓解肌无力症状；改善肌纤维线粒体超微结构；改善中性粒细胞/淋巴细胞(NLR)比值，其治疗机制可能与抗体的抑制合成和加速清除有关，并可能通过调节免疫等的作用，降低炎症反应，提示SCIg对实验性重症肌无力模型具有治疗作用，为临床运用SCIg治疗重症肌无力提供实验依据。
近年来，国内外已有许多学者正积极探索MG的治疗药物，免疫球蛋白(immune globulin)作为一种传统的免疫调节药物已被广泛应用于感染性和自身免疫性疾病的治疗。在MG方面主要采用静脉免疫球蛋白(intravenous immunogloblin ， IVIg )治疗难治性MG和肌无力危象。皮下免疫球蛋白(Subcutaneous immunoglobulin，SCIg)作为目前热门的新型免疫疗法，可替代其他免疫抑制药物应用于慢性自身免疫性疾病，但运用于重症肌无力保护治疗研究，目前还处于临床研究阶段。本实验将SCIg应用到小鼠实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)模型中，观察SCIg对EAMG的治疗作用，为SCIg的临床应用提供实验依据。
目的：
建立EAMG小鼠模型，以此为研究对象，通过观察SCIg对EAMG小鼠血清中AChR-Ab滴度、IgG水平、外周血血细胞计数、中性粒细胞/淋巴细胞比值(NLR)及肌肉组织中肌纤维和线粒体超微结构的影响，来评估SCIg的疗效，探讨SCIg治疗MG的作用机制，为临床运用SCIg治疗重症肌无力提供实验依据。
方法：
1.应用鼠源性AChR-α亚基97-116肽段建立EAMG小鼠模型
通过使用人工合成的鼠源性AChR-α亚基97-116肽段，主动免疫C57BL/6小鼠来建立实验动物模型。将50只健康SPF级雌性C57BL/6小鼠(年龄6w-7w)，体重(18g-20g)随机分为正常组和模型组。在模型组小鼠背部取两点及双足垫部位皮下注射含50μg鼠源性AChR-α亚基97-116肽段的乳剂200μL，正常组小鼠在相同位置给予200μL的佐剂与PBS的混合乳剂。初次免疫后第4周、第8周及第12周分别于背部两点及左右大腿给予同等剂量来进行第二次、第三次、第四次的加强免疫。初次免疫后第13周通过肌力评分和悬挂实验综合评价小鼠肌力情况；ELISA法检测小鼠血清中AChR-Ab水平；新斯的明实验检测小鼠行为学变化以及肌电图检测肌力等综合评价模型是否成功。
2.SCIg对EAMG小鼠的治疗作用及机制研究
将最终纳入EAMG标准的小鼠分为EAMG组、泼尼松组、SCIg高剂量组、SCIg低剂量组。泼尼松组给予泼尼松9mg/kg·d灌胃；SCIg组采取皮下注射SCIg给药2周，每周注射2次，每次间隔2天，第一周SCIg高剂量和SCIg低剂量组都给予2.25g/kg皮下注射，第二周SCIg高剂量组给予4.5g/kg皮下注射，SCIg低剂量组给予2.25g/kg皮下注射，每次注射部位包括背部、大腿或臀部，并适当保持距离；正常组及EAMG组每日给予生理盐水0.2mL灌胃。给药两周后，通过ELISA法分析血清中AChR-Ab和IgG浓度、血细胞分析仪检测小鼠外周血血细胞计数，计算中性粒细胞/淋巴细胞比值(NLR)以及电镜观察肌纤维和线粒体超微结构来评估SCIg疗效，探讨治疗机制。
结果：
1.成功建立实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)小鼠模型
造模45只小鼠中成功的EAMG小鼠18只。EAMG小鼠体重下降、运动迟缓，毛发无光泽，抓力下降。正常组小鼠活动正常，毛发光泽，抓力正常。EAMG小鼠肌力评分(1.11±0.10)与正常组小鼠(0.00±0.00)相比显著升高(P＜0.01)；EAMG小鼠悬挂时间(129.50±7.91s)与正常组小鼠(349.60±8.91s)相比显著下降(P＜0.01)；EAMG小鼠血清AChR-Ab水平(0.52±0.03)与正常组小鼠(0.13±0.01)相比显著升高(P＜0.01)；随机挑选的模型组小鼠在新斯的明实验及肌电图实验中结果为阳性。
2.SCIg对EAMG小鼠治疗作用及机制研究
2.1Lennon评分变化：与EAMG组相比，SCIg高剂量组(0.70±0.12，P＜0.01)，SCIg低剂量组(0.80±0.12，P＜0.01)，泼尼松组(0.63±0.13，P＜0.01)的Lennon评分明显低于EAMG组(1.63±0.13)。与正常组Lennon评分(0.00±0.00)相比，EAMG组(1.63±0.13)的Lennon评分显著增加(P＜0.01)。SCIg高剂量组Lennon评分与SCIg低剂量组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。泼尼松组与SCIg高、低剂量组Lennon评分比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.2AChR-Ab水平的变化：与EAMG组相比，SCIg高剂量组(0.17±0.03，P＜0.01)、SCIg低剂量组(0.22±0.03，P＜0.05)和泼尼松组(0.13±0.03，P＜0.01)的AChR-Ab水平明显低于EAMG组(0.39±0.05)。与正常组AChR-Ab水平(0.12±0.02)相比，EAMG组(0.39±0.05)的AChR-Ab水平显著增加(P＜0.01)。SCIg高剂量组AChR-Ab水平与SCIg低剂量组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。泼尼松组与SCIg高、低剂量组AChR-Ab水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.3IgG浓度的变化：与EAMG组相比，SCIg高剂量组(23.51±2.65mg/mL，P＜0.05)和泼尼松组(16.15±4.26mg/mL，P＜0.05)的IgG浓度明显低于EAMG组(37.20±5.56mg/mL)，SCIg低剂量组(29.49±0.54mg/mL)与EAMG组相比有下降趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。与正常组IgG浓度(17.13±2.01mg/mL)相比，EAMG组IgG浓度(37.20±5.56mg/mL)显著升高(P＜0.01)。SCIg高剂量组IgG浓度与SCIg低剂量组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。泼尼松组与SCIg高、低剂量组IgG浓度比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.4血细胞计数的变化：白细胞计数：与EAMG组白细胞计数(4.50±0.41)×109/L相比，泼尼松组(2.69±0.60)×109/L的白细胞计数降低(P＜0.05)。淋巴细胞计数：与EAMG组淋巴细胞计数(2.02±0.16)×109/L相比，泼尼松组(1.13±0.28)×109/L淋巴细胞计数降低(P＜0.05)。与正常组淋巴细胞数量(9.69±0.53)×109/L相比，EAMG组淋巴细胞数量(2.02±0.16)×109/L降低(P＜0.05)。中性粒细胞计数：泼尼松组(1.15±0.25)×109/L和SCIg高剂量组(1.46±0.13)×109/L的中性粒细胞计数低于EAMG组(3.11±0.67)×109/L(P＜0.05)，SCIg低剂量组(1.60±0.25)×109/L的中性粒细胞计数与EAMG组相比无统计学意义(P＞0.05)。与正常组中性粒细胞计数(0.67±0.12)×109/L相比，EAMG组(3.11±0.67)×109/L显著升高(P＜0.01)。
2.5中性粒细胞/淋巴细胞比值(NLR )的变化：与EAMG组NLR比值(1.56±0.36)相比，SCIg高剂量组NLR比值(0.60±0.13)降低(P＜0.05)，泼尼松组(1.06±0.08)、SCIg低剂量组(0.90±0.23)NLR比值无统计学意义(P＞0.05)。与正常组小鼠NLR比值(0.183±0.024)相比，EAMG组小鼠NLR比值(1.56±0.36)显著增加(P＜0.01)。与泼尼松组相比，SCIg高剂量组NLR比值(0.60±0.13)降低(P＜0.05)，SCIg低剂量组NLR比值(0.90±0.23)无统计学意义(P＞0.05)。SCIg高剂量组NLR比值与SCIg低剂量组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.6肌纤维及线粒体超微结构的变化：电镜检测正常组小鼠肌纤维及线粒体超微结构正常，EAMG组存在肌纤维稀疏、紊乱，线粒体减少、出现云絮状病变及空泡化等超微结构改变，泼尼松组存在肌纤维紊乱，线粒体空泡化，SCIg高、低剂量组能够改善上述病理改变。
结论：
通过人工合成的鼠源性AChR-ɑ亚基97-116肽段可成功建立EAMG小鼠模型。和泼尼松组改善EAMG小鼠症状情况相似，SCIg能降低EAMG小鼠的肌力评分、缓解肌无力症状；改善肌纤维线粒体超微结构；改善中性粒细胞/淋巴细胞(NLR)比值，其治疗机制可能与抗体的抑制合成和加速清除有关，并可能通过调节免疫等的作用，降低炎症反应，提示SCIg对实验性重症肌无力模型具有治疗作用，为临床运用SCIg治疗重症肌无力提供实验依据。