水稻早衰突变基因Ospse的克隆及功能研究

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衰老是由多基因控制的复杂生命现象。研究植物叶片衰老不仅能够加深对这一基础生物学过程的理解,还能够提供控制叶片衰老,改善作物农艺性状的方法。本研究对一个自然发生的水稻早衰突变体pse进行鉴定,通过图位克隆的方法分离到了该早衰突变基因Ospse,并对该基因功能进行了研究。主要研究结果如下: ⑴鉴定了一份籼稻来源的早衰突变体,命名为pse。该突变体在孕穗期开始出现叶片早衰,生育后期早衰表现更加严重。遗传分析表明该突变性状受一对隐性基因控制,命名为Ospse。 ⑵构建了3个籼粳杂交的F2定位群体,通过对6,000多F2个体进行连锁分析,将Ospse定位于第1染色体的约3.7kb的范围。序列分析表明,该区段内包含一个基因ORF15,预测编码一个假定的果胶酶。 ⑶对定位区段的测序表明,突变体pse在ORF15编码区第947bp处发生了一个碱基的缺失,导致了其编码区从1095bp延长至1191bp,而其编码的蛋白质在从突变点起发生了移码突变。 ⑷半定量RT-PCR分析和参考基因芯片分析结果表明,ORF15在水稻各个组织中表达量较低,其表达水平不会随着衰老进程而改变。ORF15在野生型和突变体之间的表达水平没有明显的差异。 ⑸通过转基因功能互补试验和在突变体中超量表达ORF15基因,能够使突变体恢复野生表型,证明ORF15即是目的基因OsPSE。 ⑹构建了4个亚细胞定位相关载体,利用基因枪法转化洋葱表皮细胞,瞬时表达OsPSE与GFP的融合基因,初步确定OsPSE定位于细胞质和细胞核。 ⑺为了研究OsPSE基因的组织表达特异性,将其启动子与GUS的基因融合,转化水稻。结果表明OsPSE基因在各个组织中都有表达,在根和茎组织中表达量相对较高,叶片和小穗中表达量较低。 ⑻对pse与野生型叶片和茎进行了组织切片观察,发现二者在茎的组织结构上包括微管束存在较大差异,突变体的维管束变小,厚壁组织减少。 ⑼pse与野生型叶片在衰老临界期的叶绿素含量、光合效率、可溶性糖含量的等生理指标没有显著差别,表明该突变不影响水稻的光合作用效能。 ⑽构建了野生型OsPSE基因的诱饵载体,利用酵母双杂交技术筛选水稻叶片cDNA文库,初步鉴定了3类双杂交阳性蛋白。经过互作验证,确认OsPSE能够与2个泛素蛋白发生相互作用,并发现突变Ospse蛋白不能与这2个泛素蛋白发生相互作用。本结果暗示,泛素介导的OsPSE蛋白修饰是调控其活性的重要方式。 ⑾探讨了Ospse突变导致早衰的可能机理,认为Ospse突变影响了水稻茎组织尤其维管束的正常发育,导致养分输送能力下降,使之难以维持中后期叶片的机能而发生早衰。
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