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本论文研究功能化乳酸类聚合物作为载药纤维、表面活性材料、蛋白质固载和纯化材料、以及靶向药物载体等的生物学性能和应用,按照聚乳酸生物功能由低级到高级的顺序、从高分子科学和生物医学学科交叉的角度考察药物纤维的抑瘤效果,利用功能化的乳酸类聚酯材料构建生物活性表面,探讨功能化的乳酸类聚合物固载蛋白的能力和纯化蛋白的功能,研究功能化的乳酸类聚酯作为靶向药物载体的能力,以及使其在生物学领域内更高效、更广泛地应用。
(1)制备了担载阿霉素(DOX)的PLA—PEG纤维毡。并进行了PLA—PEG聚合物纤维毡的生物安全性评价,对药物控释纤维的体外抑瘤作用进行了考察,将载药纤维植入荷瘤小鼠肿瘤部位试验动物体内抑瘤效果。研究发现:PLA—PEG聚合物纤维毡具有很好的生物相容性和生物安全性,没有毒性和副作用。载阿霉素(DOX)纤维在杀伤SMMC-7721肝癌细胞的体外实验中展现了优于纯药的抗肿瘤效果和长时间的持续杀伤效果。缓释剂植入组C-57BL小鼠的H22肝癌肿瘤体积增大速度和肿瘤重量都明显减小,肿瘤生长抑制率65.13%,明显高于瘤内注射组的36.33%和静脉注射组的24.82%(P<0.001);缓释剂植入组瘤体坏死程度明显加重;缓释剂植入组的细胞凋亡数(caspase-3/fas)分别为20±3%/12±2%,明显高于瘤内注射组的9±2%/7±1%、静脉注射组的6±1%/6±1%和对照组的1±1%/1±1%(P<0.001),缓释剂植入组的流式细胞凋亡率为24.21%±0.05也明显高于瘤内注射组的15.67%±0.03、静脉注射组的15.04%±0.02和对照组的10.90%±0.01(p<0.001)。
(2)制备了一种具有生物活性的、没有非特异性蛋白质吸附的高分子包被物表面。制备该包被物表面使用的高分子是可降解的、油水两亲性的三嵌段聚合物,即生物素偶联的聚乙二醇-聚丙交酯-聚赖氨酸共聚物。方法是将高分子溶解于氯仿,涂布在预先包被了Sigma聚赖氨酸的脱脂玻片基质上,制备高分子包被物,再在高分子包被物表面包被一层由明胶和聚N-乙烯吡咯烷酮组成的封闭剂,以排除表面的非特异性吸附。然后,对高分子包被物表面的生物活性进行评价:1)酶标免疫分析法。方法是:顺序地将辣根过氧化物酶标记的链亲和素,生物素偶联的小鼠球蛋白抗原,和碱性磷酸酶标记的马抗小鼠抗体固载在高分子包被物表面上,通过标记的酶与底物作用生色,进行分析:2)荧光标记免疫分析法。方法是顺序地将链亲和素,生物素化的兔抗山羊抗体和异硫氰酸荧光素标记的山羊球蛋白抗原固载在高分子包被表面上,通过激光共聚焦显微镜检测最后的荧光信号,进行分析。结果:经过封闭以后,具有生物活性的高分子包被物表面,能够排斥非特异性的蛋白质;同时特异性蛋白质之间,像生物素和链亲和素之间、抗原和抗体之间的相互作用依然保留,并且固定在表面的蛋白质依然保留生物活性。
(3)制备了poly(L-lactide-co-glycolide)和biotin偶联的poly(ethylene
glycol)-b-poly(L-lactide)-b-poly(L-lysine)的混纺纤维,纤维直径ca.2微米。纤维上依次成功的固载了streptavidin、biotinylated antibodies、antigens。Antigens可以用glycine/HCl solution洗脱下来。实验中用酶标免疫法(EIA)定性检测固载的streptavidin,用激光工具焦显微镜(CLSM)定性检测蛋白质的特异性固载和非特异性吸附,用BCA法对固载的蛋白质定量。结果纤维的非特异性蛋白吸附被排阻,可以特异性的固载目的蛋白,固载的蛋白保留生物活性。纤维对于streptavidin、biotinylated antibodies、antigens等蛋白质的固载能力分别为0.289±0.020、0.615±0.084、0.261±0.038 mg·g-1。Antigens的洗脱效率为ca89%,抗原活性保留ca85%。
(4)将嵌段聚合物聚乳酸-聚半胱氨酸(PLA-PCys)纺丝制成纤维,将还原型谷胱甘肽(GSH)通过二硫键偶联到纤维上,随后将纤维制成滤器芯;用乳糖同系物isopropylβ-D thiogalactoside(IPTG)诱导大肠杆菌表达型谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因系统表达GST,再裂解IPTG诱导的菌液,获得含有GST的蛋白混合液。然后,将蛋白混合液从纤维滤芯滤过,经过洗脱、冻干而获得蛋白质干品。蛋白质干品以及相关的蛋白质都用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。结果,GSHGSH偶联的纤维成功地将GST从蛋白混合液中分离和纯化,效率为1.17 mg·g-1PLA-PCys。
(5)制备了叶酸偶联的嵌段聚合物methoxy-poly(ethyleneglycol)-b-poly(L-lactide)-b-poly(L-lysine)(简写为Folate(+)copolymer),摩尔比2.1:1。将纯methoxy-poly(ethylene glycol)-b-poly(L-lactide)-b-poly(L-lysine)与Folate(+)copolymer混合或者不混合,并将荧光探针FITC包裹制备带叶酸胶束(folate(+)micelles)或者无叶酸胶束(folate(-)micelles)。folate(+)micelles表现为叶酸受体(FR)介导的细胞选择性,在FR过表达的HeLa细胞表现为内吞、FR不表达的CHO细胞表现为几乎不吞噬。folate(-)micelles表现为没有细胞选择性,在两类细胞中皆表现为吞噬。小鼠的冰冻组织切片用以研究胶束的动物体内分布,实验结果表明folate(+)micelles更多的聚集在肿瘤组织部位,而folate(-)micelles则更多被肝脏等器官组织吞噬。