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目的：
急性肺损伤(ALI)是以通透性肺水肿为特征的一种临床综合征，其严重阶段即急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。目前ALI/ARDS的发病机理尚未完全阐明。以往人们普遍认为，肺水肿主要是由于肺微血管内皮细胞(PMEC)受损所致，而对肺组织存在的水通道蛋白(AQPs)在病理生理条件下的作用认识不足。在ALI/ARDS中水通道蛋白-1(AQP-1)、水通道蛋白-3(AQP-3)和水通道蛋白-5(AQP-5)在基因、蛋白水平的表达以及液体转运功能的变化缺乏研究，其对肺水肿形成的影响尚不清楚。而促炎消退因子脂氧素(LXs)对AQP-1、AQP-3、AQP-5是否有保护作用也缺乏相应的研究。为此，本研究围绕大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)，探讨脂氧素A4(LXA4)对脂多糖(LPS)攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)水通道蛋白(AQP)-1、3、5的影响。
方法：
1.用胰酶消化和免疫贴壁的方法分离纯化大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞，通过碱性磷酸酶(AKP)染色和电镜鉴定得到纯度≥90％的肺泡Ⅱ型上皮细胞。分别用0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml的脂多糖(LPS)刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞，并利用细胞增殖/毒性检测试剂(CCK-8)在刺激2h、4h、6h后分别检测肺泡Ⅱ型上皮细胞的抑制率，从而摸索出内毒素性肺损伤细胞模型中最适的脂多糖浓度和刺激时间。
2.将细胞随机分为：①组为溶剂对照(乙醇，0.7μl/ml)组；②组为空白组(无血清的培养基不含任何药物)；③组为LXA4(1×10-7mol/ml)组；④组为LPS(1μg/ml)组；⑤组为LPS+ LXA4(1μg/mlLPS+1×10.7mol/ml LXA4)组。
3.药物刺激4h后用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞上AQP-1、AQP-3和AQP-5的mRNA的表达，免疫组织化学方法(IHC)检测肺泡Ⅱ型上皮细胞上AQP-1、AQP-3和AQP-5蛋白的表达。试验重复6次。
4.所有数据以均数±标准差(x±s)表示，以SPSS13.0统计软件进行分析处理，所有数据用单因素方差分析后用Tukeys检验进行多组间的比较。P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示统计学上有显著差异。
结果：
1.光学显微镜下观察原代培养的肺Ⅱ型细胞18 h开始贴壁，外观呈多边形，岛状生长。培养24～48 h，细胞连接成单层，胞浆内颗粒明显，透射电镜可见胞浆内含有数量不等、大小不一的特征性板层小体。且用AKP染色及电镜观察进行细胞纯度判断，未用差异贴壁去除成纤维细胞和IgG免疫黏附去除巨噬细胞纯化前，纯度达(70.4±4.8)％，纯化后可提高至(90.2±3.4)％；台盼兰染色细胞活力≥93％。
2.CCK-8检测结果：用LPS干预ATⅡ，ATⅡ出现明显的细胞抑制，三个浓度梯度组与对照组相比，均出现了明显的细胞抑制(P<0.01)。其中刺激浓度为1μg/ml时，与其他三个实验组相比，细胞毒性反应最大(P<0.01)，且在各个浓度的不同刺激时间里，4h时，细胞毒性反应最大(P<0.01)，因此可以确定LPS刺激致内毒素性肺损伤细胞模型的最适刺激浓度为1μg/ ml，最佳刺激时间为4h。
3.AQP-1： RT-PCR结果显示，空白组AQP-1mRNA有表达，对比空白组，LPS模型组明显降低，差别有统计学意义(P<0.01)；而对比LPS模型组，LXA4和LPS+LXA4组AQP-1mRNA的表达均明显增高，差别有统计学意义(P<0.01)； AQP-3和AQP-5： RT-PCR结果显示，空白组AQP-3、AQP-5 mRNA均有表达，对比空白组，LPS模型组明显降低，LXA4组和LPS+LXA4组均有增高，差别有统计学意义(P<0.01)：而对比LPS模型组，LXA4和LPS+LXA4组AQP-3、AQP-5 mRNA的表达均明显增高，差别有统计学意义(P<0.01)。
4.五组大鼠ATⅡ细胞AQP-1、AQP-3和AQP-5均呈阳性染色，细胞膜上及浆内呈棕褐色，阴性对照无染色。
AQP-1：对比空白组，LPS模型组阳性细胞率明显降低， LPS+LXA4组明显增高，差别有统计学意义(P<0.01)；而对比LPS模型组，LXA4和LPS+ LXA4组阳性细胞率明显增高，差别有统计学意义(P<0.01)。AQP-3和AQP-5：对比空白组，LPS模型组阳性细胞率明显降低，LXA4组和LPS+LXA4组均有增高，差别有统计学意义(P<0.01)；而对比LPS模型组，LXA4和LPS+ LXA4组阳性细胞率均明显增高，差别有统计学意义(P<0.01)。
结论：
1.细胞分离后采用差异贴壁法和免疫黏附法进行纯化可使细胞纯度提高18％左右；
2.用1μg/ml脂多糖刺激体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞4h能建立较为合理的内毒素性肺损伤细胞模型；
3.大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞上表达有AQP-1、AQP-3和AQP-5，LXA4能促进脂多糖攻击的肺泡Ⅱ型上皮细胞上AQP-1、AQP-3和AQP-5mRNA和蛋白表达上调。