【摘 要】
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目的:本实验通过 Aspergillus固态发酵,分离纯化制备β-葡萄糖苷酶,并利用β-葡萄糖苷酶催化人参皂苷和N-乙酰葡萄糖胺,形成新的氨基糖皂苷,从而期望获得高效低毒的新型人参
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目的:本实验通过 Aspergillus固态发酵,分离纯化制备β-葡萄糖苷酶,并利用β-葡萄糖苷酶催化人参皂苷和N-乙酰葡萄糖胺,形成新的氨基糖皂苷,从而期望获得高效低毒的新型人参皂苷,为皂苷生物转化研究提供新的方向和思路。 方法:首先,将 Aspergillus发酵所得的粗酶分别经过 Sephadex-G150和DEAE-Sephadex-A50分离纯化,获得较纯的β-葡萄糖苷酶。其次,将新鲜人参切片,洗净,在50℃烘干,粉碎。分别用70％的乙醇回流提取,乙酸乙酯和正丁醇萃取。正丁醇萃取部分经 D101大孔树脂的纯化,真空冷冻干燥后得到人参总皂苷。第三,将人参皂苷、N-乙酰葡萄糖胺和β-葡萄糖苷酶按照以下三种添加方式进行反应:第一组,将人参皂苷、N-乙酰葡萄糖胺和β-葡萄糖苷酶同时放入;第二组,先加入人参皂苷和β-葡萄糖苷酶,后加入 N-乙酰葡萄糖胺继续反应;第三组,先加入 N-乙酰葡萄糖胺和β-葡萄糖苷酶,后加入人参皂苷。再次,将转化总产物经过 ODS-C18反相硅胶分离纯化,得到的各部分转化产物同人参总皂苷和总转化产物进行体外抗肿瘤活性评价。 结果:从 Aspergillus发酵得到的β-葡萄糖苷酶经 Sephadex-G150和DEAE-Sephadex-A50分离纯化后,最终通过 SDS-PAGE测定去分子量为97.5KD左右,较原粗酶纯化了26.84倍,说明β-葡萄糖苷酶已经得到较好的分离。三种转化方式通过 ESI-MS分析,第二种转化方法最好。在33min对应的质谱为[M+Na]+979.9,[M+K]+995.6,推测其分子量为957.6,发生氨基糖的酶催化反应。通过第二种转化方式进行放大实验,获得的总转化产物经 ODS-C18反相硅胶分离后得到35％(甲醇)、35％(乙腈)、45％(乙腈)和55％(乙腈)四部分转化产物。将这四种转化产物和人参总皂苷和总转化产物进行 HepG2肝癌细胞和caski宫颈癌细胞体外抗肿瘤活性实验比较,其中55％转化产物的抗肿瘤活性为显著。当其浓度为100μg/ml时对 HepG2肝癌细胞和caski宫颈癌细胞的抑制率分别为41％和46.89％。结论:β-葡萄糖苷酶能在一定的条件下催化人参皂苷和N-乙酰葡萄糖胺发生转化反应。但只有第二种工艺发生了N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖的转移反应,所得到的新的N-乙酰氨基糖代皂苷化合物转化率较高,第一种工艺和第三种工艺主要发生的β-葡萄糖苷酶的酶水解反应。第二种转化方式的得到的转化产物的体外抗肿瘤活性与总皂苷和转化总产物有所提高,尤其是55％转化产物随着浓度的升高,抗肿瘤活性增强。
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