铁盐及副溶血弧菌胁迫下福建牡蛎差异蛋白质组学及免疫相关基因表达的研究

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牡蛎隶属于软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Bivalvia)珍珠贝目(Pterio)。牡蛎具有很高的食用价值,现已成为中国乃至世界养殖产量最大的经济贝类。然而牡蛎养殖业面临着种种威胁,其中包括了病原体的感染。  铁是脊椎动物血红蛋白的重要组成成分,对机体免疫机制也具有重要作用。但铁对无脊椎动物免疫系统的影响鲜有研究。本论文以福建牡蛎为实验物种,以牡蛎的血淋巴和鳃为实验材料,选择铁盐为胁迫方法和诸多分析技术研究铁盐对牡蛎血淋巴和鳃产生的的影响。  本文采用3 mg/L的铁盐胁迫牡蛎96小时,之后用副溶血弧菌对牡蛎进行攻毒。经过计数,经过铁盐胁迫的牡蛎死亡率明显小于对照组。这种现象初步说明铁盐可以有效提高牡蛎对副溶血弧菌感染的抵抗能力。  为了更好地研究铁如何改善牡蛎的免疫能力,选取了多种牡蛎吞噬作用与造血功能相关的基因:Integrin,PI3K,Rho J,MAPKK,PKC,Myosin,Actin,Rab32,NADPH oxidase,GATA3,Runx1,BMP7。通过Real-time qPCR的技术检测这些基因的mRNA在铁盐的胁迫下的表达情况。采用0 mg/L,1 mg/L,2mg/L,3 mg/L,4 mg/L的铁盐对牡蛎进行胁迫96小时,并选取3 mg/L的铁盐浓度下,分别对铁盐胁迫0h,4h,8h,12h,24h,36h,48h,60h,72h,84h,96h后的血淋巴采样。通过qPCR的技术检测这些相关基因在不同离子浓度和不同胁迫时间下的表达量。与对照相比,经过铁盐胁迫的牡蛎的血淋巴中,吞噬作用和造血作用相关的基因有明显的上调趋势。说明了铁盐对牡蛎的免疫功能有增强的作用。  为了更加全面地研究铁如何改善牡蛎免疫系统,以福建牡蛎的血淋巴和鳃为实验材料,以蛋白质组学为技术对差异蛋白进行筛选。共在血淋巴中鉴定出587个差异蛋白,在鳃中鉴定出431个差异蛋白。通过对比,在相同组织不同胁迫的差异蛋白中,找到了101个有相同趋势的差异蛋白,其中血淋巴中79个,鳃中22个。通过对这些相同趋势的差异蛋白的分析,我们可以了解牡蛎分别收到铁和弧菌的胁迫时,产生的相同的应激反应,进一步解释铁对牡蛎免疫功能的增强作用。为了了解这些蛋白在转录水平的变化,选取了Filamin-A,Tropomyosin,Cathepsin,Apolipoprotein D等蛋白的基因。采用Real-timeqPCR技术测定了这些基因的表达水平,发现其表达量趋势与蛋白质组学鉴定出的趋势相同,进而证明了结果的可信度。  本论文所获得的研究结果有助于进一步深入探索铁盐对牡蛎免疫系统的影响。所筛选出来部分差异蛋白可以更好地说明牡蛎在这两种不同胁迫方式下,具有的相同的应激反应,可以更好地解释分子水平上铁盐如何提高牡蛎免疫能力,为牡蛎育种提供更加丰富的资料。
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