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目的:
内毒素性急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合症(ARDS)是临床上常见的危重病症,其死亡率高达40-60％。肺水肿是内毒素性肺损伤并发急性呼吸功能衰竭的主要病理基础,肺泡水肿液的及时主动清除对急性肺损伤的预后有重要影响。肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)上的Na+-K+-ATP酶对肺水清除和维持细胞屏障功能起着重要作用。脂氧素成员脂氧素A4(LxA4)是体内重要内源性促炎症消退介质,对多种炎症细胞和炎症相关基因有显著的负性调节作用,是炎症反应的重要“刹车信号”。本研究围绕大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ),探讨促炎症消退介质脂氧素A4(LXA4)对脂多糖(LPS)攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)Na+-K+-ATP酶及细胞能量负荷的影响。
方法:
1.用胰酶消化和免疫贴壁的方法分离纯化大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞,通过碱性磷酸酶(AKP)染色和电镜鉴定得到肺泡Ⅱ型上皮细胞。
2.将细胞随机分为:①组为空白组(PBS)；②组为溶剂对照(乙醇,0.7μl/ml)组；③组为LPs(1μg/ml)组；④组为LXA4(1×10-7mol/ml)组；⑤组为LPS+LXA4(1μg/mlLPS+1×10-7 mol/ml LXA4)组。药物刺激4h后进行各项指标检验。
3.用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞上Na+-K+-ATP酶α1、β1亚基mRNA的表达；
4.免疫组化法检测大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞上Na+-K+-ATP酶α1、β1亚基蛋白的表达:
5.试剂盒法检测Na+-K+-ATP酶的活性；高效液相法测定细胞ATP、ADP、AMP和腺嘌呤核苷酸总量(TAN),间接测得Na+-K+-ATF酶的活性；
6.高效液相法测定肺泡Ⅱ型上皮细胞能荷(EC)；
7.用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测肺泡Ⅱ型上皮细胞脂氧素受体的表达。
8.所有数据以均数±标准差(()x±s)表示,以SPSS13.0统计软件进行分析处理,按照Analyze-General linear Model→Univariate过程进行方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义,P<0.01表示统计学上有显著差异。
结果:
1.肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)上Na+-K+-ATP酶α1、β1亚基mRNA的表达α1:与空白组比较,LPS刺激组α1亚基mRNA的表达明显降低(P<0.05)；与LPS刺激组比较,LPS+LXA4治疗组α1亚基mRNA的表达明显增高(P<0.01)。β1:与空白组比较,LPS刺激组β1亚基mRNA的明显降低(P<0.05)；与LPS刺激组比较,LPS+LXA4治疗组β1亚基mRNA的表达明显增高(P=0.01)。
2.肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)上Na+-K+-ATP酶α1、β1亚基蛋白的表达ATⅡ上α1、β1亚基蛋白均有表达,各组亚基蛋白的表达量无显著性差异(P>0.05)。
3.肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)上Na+-K+-ATP酶的活性与空白组比较,LPS刺激组、LPS+LXA4治疗组Na+-K+-ATP酶活性均明显增高(P<0.05),与LPS组比较,LPS+LXA4治疗组酶活性亦有明显增高(P<0.05),试剂盒法和高效液相法两者结果基本一致。
4.肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)的能荷与其它各组比较,LPS刺激组能荷显著升高(P<0.01),其余各组间无显著性差异(P>0.05)。
5.肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)上有脂氧素受体表达。
结论:
1.LXA4能上调内毒素攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Na+-K+-ATP酶α1、β1亚基mRNA表达；
2.LXA4对内毒素攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Na+-K+-ATP酶亚基蛋白表达无明显作用；
3.LXA4能增强内毒素攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Na+-K+-ATP酶的活性；
4.LXA4能维持内毒素攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的能量代谢平衡；
5.LXA4可能是在外来刺激启动炎症后才对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Na+-K+-ATP酶和能荷发生作用；
6.LXA4可能通过受体依赖调控Na+-K+-ATP酶。
内毒素性急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合症(ARDS)是临床上常见的危重病症,其死亡率高达40-60％。肺水肿是内毒素性肺损伤并发急性呼吸功能衰竭的主要病理基础,肺泡水肿液的及时主动清除对急性肺损伤的预后有重要影响。肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)上的Na+-K+-ATP酶对肺水清除和维持细胞屏障功能起着重要作用。脂氧素成员脂氧素A4(LxA4)是体内重要内源性促炎症消退介质,对多种炎症细胞和炎症相关基因有显著的负性调节作用,是炎症反应的重要“刹车信号”。本研究围绕大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ),探讨促炎症消退介质脂氧素A4(LXA4)对脂多糖(LPS)攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)Na+-K+-ATP酶及细胞能量负荷的影响。
方法:
1.用胰酶消化和免疫贴壁的方法分离纯化大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞,通过碱性磷酸酶(AKP)染色和电镜鉴定得到肺泡Ⅱ型上皮细胞。
2.将细胞随机分为:①组为空白组(PBS)；②组为溶剂对照(乙醇,0.7μl/ml)组；③组为LPs(1μg/ml)组；④组为LXA4(1×10-7mol/ml)组；⑤组为LPS+LXA4(1μg/mlLPS+1×10-7 mol/ml LXA4)组。药物刺激4h后进行各项指标检验。
3.用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞上Na+-K+-ATP酶α1、β1亚基mRNA的表达；
4.免疫组化法检测大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞上Na+-K+-ATP酶α1、β1亚基蛋白的表达:
5.试剂盒法检测Na+-K+-ATP酶的活性；高效液相法测定细胞ATP、ADP、AMP和腺嘌呤核苷酸总量(TAN),间接测得Na+-K+-ATF酶的活性；
6.高效液相法测定肺泡Ⅱ型上皮细胞能荷(EC)；
7.用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测肺泡Ⅱ型上皮细胞脂氧素受体的表达。
8.所有数据以均数±标准差(()x±s)表示,以SPSS13.0统计软件进行分析处理,按照Analyze-General linear Model→Univariate过程进行方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义,P<0.01表示统计学上有显著差异。
结果:
1.肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)上Na+-K+-ATP酶α1、β1亚基mRNA的表达α1:与空白组比较,LPS刺激组α1亚基mRNA的表达明显降低(P<0.05)；与LPS刺激组比较,LPS+LXA4治疗组α1亚基mRNA的表达明显增高(P<0.01)。β1:与空白组比较,LPS刺激组β1亚基mRNA的明显降低(P<0.05)；与LPS刺激组比较,LPS+LXA4治疗组β1亚基mRNA的表达明显增高(P=0.01)。
2.肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)上Na+-K+-ATP酶α1、β1亚基蛋白的表达ATⅡ上α1、β1亚基蛋白均有表达,各组亚基蛋白的表达量无显著性差异(P>0.05)。
3.肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)上Na+-K+-ATP酶的活性与空白组比较,LPS刺激组、LPS+LXA4治疗组Na+-K+-ATP酶活性均明显增高(P<0.05),与LPS组比较,LPS+LXA4治疗组酶活性亦有明显增高(P<0.05),试剂盒法和高效液相法两者结果基本一致。
4.肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)的能荷与其它各组比较,LPS刺激组能荷显著升高(P<0.01),其余各组间无显著性差异(P>0.05)。
5.肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)上有脂氧素受体表达。
结论:
1.LXA4能上调内毒素攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Na+-K+-ATP酶α1、β1亚基mRNA表达；
2.LXA4对内毒素攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Na+-K+-ATP酶亚基蛋白表达无明显作用；
3.LXA4能增强内毒素攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Na+-K+-ATP酶的活性；
4.LXA4能维持内毒素攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的能量代谢平衡；
5.LXA4可能是在外来刺激启动炎症后才对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Na+-K+-ATP酶和能荷发生作用；
6.LXA4可能通过受体依赖调控Na+-K+-ATP酶。