论文部分内容阅读
目的：获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)简称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的一种危害性极大的传染病，目前尚无法彻底根治。高效抗逆转录病毒治疗（Highly active antiretroviral therapy，HAART）是目前世界范围内公认的对抗艾滋病最有效的疗法。我国从2003年在全国范围内广泛推行一线抗艾滋病药物，推荐采用的一线治疗方案为2种核苷类抑制剂(Nucleotide Analogue ReverseTranscriptase Inhibitors，NRTIs)+1种非核苷类抑制剂(Nonnucleotide AnalogueReverse Transcriptase Inhibitors，NNRTIs)，具体用药情况为齐多夫定/司他夫定(Zidovudine/Stavudine，AZT/D4T)+去羟基苷/拉米夫定(Didanosine/Lamivudine，DDI/3TC)+依法韦仑/奈韦拉平(Efavirenz/Nevirapine，EFV/NVP)。但同发达国家相对丰富的药物资源相比，我国一线所使用的抗病毒治疗药物较为单一，患者出现耐药后很难及时更换药物，这就导致了高耐药率的产生。面对一线药物严峻的耐药形式，我国于2009年4月以河南省为试点开展二线抗病毒治疗，二线抗病毒治疗方案主要是1种蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitors，PIs)+2种核苷类抑制剂(NRTIs)，即拉米夫定(3TC)+替诺福韦(Tenofovir，TDF)+克立芝(Lopinavir/ritonavir, Lpv/r)。截止目前，二线抗病毒治疗方案已在我国实行了6年。从国内目前现有的二线报道来看，换药后12个月内患者的CD4+T淋巴细胞较患者换药前有所增长，病毒载量有所下降，短期内治疗效果良好。但尚缺乏针对更换二线药物后长期治疗效果的相关报道。本研究队列的前期群体水平长期监测结果显示195人更换药物前病毒抑制率为34.6％。更换二线抗病毒药物6个月后，随访157例，病毒载量抑制率升高到61.8％;随访12个月后病毒抑制率高达71.2％;随访第48个月的病毒抑制率为75.3％，且患者整体的CD4+T水平较换药前有所升高，病毒载量水平较换药前有所下降。然而仍旧存在少数患者经长期二线治疗但病毒学失败(VL＞400copies/ml)，且常规基因型耐药检测未发现耐药。排除依从性的影响后，我们推测由于二线治疗方案中沿用了一线方案中的NRTIs药物3TC，一线治疗失败后累积的NRTIs耐药可能以劣势耐药形式存在，使二线药物方案中的NRTI类药物3TC及TDF全部耐药或者部分耐药，从而导致二线治疗失败。本研究选取6名二线抗病毒治疗6年但病毒学仍然失败的患者，及9名长期治疗效果好的患者作为对照，应用深度测序技术进行耐药检测，力求充分挖掘这些患者的NRTIs相关耐药信息，明确长期二线抗病毒治疗下NRTIs耐药突变长期累积变异的特点及规律，及其对疗效的影响，为我国制定长期二线抗病毒药物治疗策略提供重要理论依据。 方法：采用回顾性队列研究，选取的研究对象来自2009年8月-2010年1月于我国河南省尉氏县建立的二线治疗随访队列，根据2007版《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册》中艾滋病病人更换二线方案的入选标准，研究队列共纳入120名患者，所有患者均签署知情同意书。从此符合换药标准的120名患者中回顾性地选取15名患者作为研究对象，入选标准如下:①换药前基线基本信息完整②二线药物服药依从性＞90％③换药前的常规基因型耐药结果显示对3TC或TDF耐药④治疗时间满48个月，根据第48个月或第72个月血浆病毒学结果，将这15人分为病毒抑制组(VL＜400copies/ml):9名患者，病毒未抑制组(VL＞400copies/ml):6名患者。具体技术路线为分别采集上述15名患者基线点及治疗失败的6名患者VL＞400copies/ml的随访点血液标本。收集15名患者人口学信息及各个血液标本所对应的CD4+T淋巴细胞计数、血浆病毒载量及In-house耐药检测数据并进行NGS(Next Generation Sequencing)基因型耐药检测。应用FASTQC、Seqeuncher和Deepchek(@)-HIV等软件对NGS数据进行下游分析和HIV耐药基因注释。另外，选取构建好的10个质控质粒标本分别进行Sanger测序和深度测序，以Sanger测序的结果为金标准，评估深度测序每个碱基位置的错误率，并计算10个质粒的平均错误率，以平均错误率95％可信区间的下限作为Deepchek(@)-HIV软件耐药突变检出的阈值。 结果：⑴基于NGS的HIV耐药检测明显优于传统In-House方法，以Sanger测序的结果为金标准，NGS基因型耐药检测的错误率为1.23(1.01-1.45)，并确定1％为Deepchek(@)-HIV软件耐药位点检出的阈值;本研究共产生6.5G的数据量，94.5％数据处于Q30以上水平，整个耐药检测区平均每个氨基酸的序列覆盖度为23457条reads;15名患者共检测到308个耐药相关位点，其中NGS和In-House共同检测到175个耐药位点，NGS额外检测到127个耐药位点。⑵更换二线抗病毒药物前，病毒抑制组和未抑制组基线人口学信息、血浆病毒载量及CD4+T细胞计数无显著性差异。⑶更换二线药物前，病毒抑制组NRTIs耐药突变多于未抑制组，但未达到统计学差异水平(P=0.07);严重影响3TC和TDF药物敏感性的M184V、K65R位点仅在病毒抑制组中被发现，而低水平复制的F77L在两组均有发现;另两类药物NNRTI和PI相关耐药位点在两组未见显著性差异。⑷6名长期治疗失败患者个体水平的纵向随访耐药结果显示，换药前基线NRTIs药物耐药相关位点的种类和准种比例随着治疗时间的延长呈递减趋势;NNRTIs耐药位点同样出现了下降趋势但并不明显，个别重要的NNRTIs耐药位点K103S，G190A，Y181C一直维持到末次随访。未发现PIs主要耐药位点。 结论：①深度测序检测发现，二线抗病毒药物长期治疗失败患者换药前存在多种NRTIs耐药突变，且同一线药物相关。②深度测序结果发现，一线治疗失败后累积的NRTIs耐药突变在长期二线治疗过程中呈减少趋势，随访6年内未发现NRTIs耐药突变对长期二线抗病毒疗效产生显著影响。③深度测序结果发现，长期二线抗病毒治疗失败者中NNRTIs耐药未随治疗时间延长消失，未发现蛋白酶抑制剂Lpv/r耐药。