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随着水产养殖业的快速发展，其出现的问题也越来越多，其中以嗜水气单胞菌为主的气单胞菌属所引起的鱼类中感染力强、发病率高的细菌性败血症受到了的大家的广泛关注。同时，以氟虫腈为主的苯基吡唑类杀虫剂，被人们广泛用于农作物和家庭卫生等的害虫防治，导致其残留物在水体、土壤、蔬菜表面等处经常被检测到，而水环境中的药物可能会对水生动物造成一定的毒害。本文以鲤鱼为动物模型，探究了嗜水气单胞菌及其联合氟虫腈对鲤鱼的氧化应激、免疫、自噬和凋亡的毒理效应机制。
1、患病鲤鱼采集于河南师范大学水产养殖基地，取其肝、肠、鳃等组织经分离纯化获得两株病原菌。16SrDNA鉴定其为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。通过预实验，本研究选用嗜水气单胞菌以及购自新乡市北环农贸市场的氟虫腈作为外源污染物。结果表明：嗜水气单胞菌和氟虫腈对鲤鱼的96h半致死浓度分别为8.21×106CFU/mL和0.37mg/L。将实验用鱼分为五组，第一组为对照组，后四组为处理组。其中第二三组用0.074mg/L的氟虫腈浸浴处理一周，随后第二、四组和第三、五组分别注射浓度为7.55×105CFU/mL和4.87×107CFU/mL的嗜水气单胞菌菌悬液，并在注射后的1、3、5、7天分别取血清和组织进行蛋白和基因水平的检测。将处理组分别命名为L1、L2、C1和C2。
2、为了了解嗜水气单胞菌及其和氟虫腈的联合作用对鲤鱼抗氧化及非特异性免疫的影响，本文检测了肝、肠、鳃和血清中相应指标的变化情况。结果表明，在血清、肠和鳃中，与对照组相比，高浓度组中谷胱甘肽过氧化物酶(microreduced glutathione, GSH)的活性呈先降低后升高的趋势，而肝中其活力变化与之相反。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)的水平先增强后降低。丙二醛(Malondialdehyde, MDA)在肝、肠、鳃中的含量与对照组相比显著增多。除了血清在整个感染期间其碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AKP)的活力与对照组相比始终显著增加外，酸性磷酸酶(Acid Phosphatase, ACP)、AKP、溶菌酶(Lysozyme, LZM)的活力与对照组相比基本上均呈先上调后下调的变化趋势。
3、为了了解嗜水气单胞菌及其和氟虫腈的联合作用对鲤鱼自噬和凋亡的影响，本文检测了自噬相关基因atg5、atg12、atg16L、LC3-II、BECN1和mTOR在处理后的鲤鱼肝、肾和脑中的表达情况。结果表明，肝中atg5、atg12、LC3-II和BECN1的表达先被显著促进后又被明显抑制，而mTOR的变化则与之完全相反。在C2处理后肾和脑中atg5、atg12、atg16L和mTOR的表达普遍高于L1和L2处理。通过WB实验，我们发现肝中LC3B蛋白在处理后的3、5天其LC3B-II与LC3B-I的比值明显变大。凋亡相关基因Bcl-2在暴露初期显著升高随后不断降低至对照组左右水平，而caspase3在整个处理期间与对照组相比都显著被抑制。虽然在第七天caspase3的表达与其他时间点相比有所升高，但其仍低于对照组。
综上所述，我们的研究结果表明，嗜水气单胞菌和氟虫腈处理可能引起鲤鱼的氧化应激，刺激非特异性免疫反应，导致鲤鱼自噬，可能在感染后期引发细胞凋亡。本研究结果为阐明鲤鱼感染嗜水气单胞菌和氟虫腈的毒性机制提供了新的见解。
1、患病鲤鱼采集于河南师范大学水产养殖基地，取其肝、肠、鳃等组织经分离纯化获得两株病原菌。16SrDNA鉴定其为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。通过预实验，本研究选用嗜水气单胞菌以及购自新乡市北环农贸市场的氟虫腈作为外源污染物。结果表明：嗜水气单胞菌和氟虫腈对鲤鱼的96h半致死浓度分别为8.21×106CFU/mL和0.37mg/L。将实验用鱼分为五组，第一组为对照组，后四组为处理组。其中第二三组用0.074mg/L的氟虫腈浸浴处理一周，随后第二、四组和第三、五组分别注射浓度为7.55×105CFU/mL和4.87×107CFU/mL的嗜水气单胞菌菌悬液，并在注射后的1、3、5、7天分别取血清和组织进行蛋白和基因水平的检测。将处理组分别命名为L1、L2、C1和C2。
2、为了了解嗜水气单胞菌及其和氟虫腈的联合作用对鲤鱼抗氧化及非特异性免疫的影响，本文检测了肝、肠、鳃和血清中相应指标的变化情况。结果表明，在血清、肠和鳃中，与对照组相比，高浓度组中谷胱甘肽过氧化物酶(microreduced glutathione, GSH)的活性呈先降低后升高的趋势，而肝中其活力变化与之相反。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)的水平先增强后降低。丙二醛(Malondialdehyde, MDA)在肝、肠、鳃中的含量与对照组相比显著增多。除了血清在整个感染期间其碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AKP)的活力与对照组相比始终显著增加外，酸性磷酸酶(Acid Phosphatase, ACP)、AKP、溶菌酶(Lysozyme, LZM)的活力与对照组相比基本上均呈先上调后下调的变化趋势。
3、为了了解嗜水气单胞菌及其和氟虫腈的联合作用对鲤鱼自噬和凋亡的影响，本文检测了自噬相关基因atg5、atg12、atg16L、LC3-II、BECN1和mTOR在处理后的鲤鱼肝、肾和脑中的表达情况。结果表明，肝中atg5、atg12、LC3-II和BECN1的表达先被显著促进后又被明显抑制，而mTOR的变化则与之完全相反。在C2处理后肾和脑中atg5、atg12、atg16L和mTOR的表达普遍高于L1和L2处理。通过WB实验，我们发现肝中LC3B蛋白在处理后的3、5天其LC3B-II与LC3B-I的比值明显变大。凋亡相关基因Bcl-2在暴露初期显著升高随后不断降低至对照组左右水平，而caspase3在整个处理期间与对照组相比都显著被抑制。虽然在第七天caspase3的表达与其他时间点相比有所升高，但其仍低于对照组。
综上所述，我们的研究结果表明，嗜水气单胞菌和氟虫腈处理可能引起鲤鱼的氧化应激，刺激非特异性免疫反应，导致鲤鱼自噬，可能在感染后期引发细胞凋亡。本研究结果为阐明鲤鱼感染嗜水气单胞菌和氟虫腈的毒性机制提供了新的见解。