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甲壳动物表皮是抵御外界复杂环境的第一道屏障。为适应环境的变化、满足个体不断成长需求，甲壳动物在不同发育阶段，必须定期蜕去旧表皮并合成新表皮。而表皮中的主要成分就是几丁质。日本沼虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(MacrobrachiumnipponenseN-acetyl-β-D-glucosaminidase,MnNAGase)和日本沼虾几丁质酶3A(M. nipponense chitinase 3A, MnCHT3A)已经被证实是几丁质降解过程中的关键酶，但在其转录后水平研究较少。MicroRNA(miRNA)已经被证实可在转录后水平抑制基因的表达，对动物的生长发育至关重要。
为了探究miRNA对MnNAGase和MnCHT3A的调控作用，本文在前期已经获取基因全长和完成SmallRNA深度测序(miRNA-Seq)的基础上，筛选主要在表皮中特异表达的miRNA，利用生物信息学的方法预测和判断miRNA的结合位点；通过实时荧光定量PCR分析miRNA和靶基因在蜕皮周期中的表达变化、离体双荧光素酶验证试验、在体显微注射实验分析预测获得的候选miRNA与其靶基因MnNAGase和MnCHT3A的相互作用，获得的结果如下：
miR-3049-5p与MnNAGase基因、miR-305-5p与MnCHT3A基因存在结合位点，具有潜在结合能力。MnNAGase的表达峰值在D0-2期，而miR-3049-5p的表达峰值在C期，两者的表达量变化情况在整个蜕皮周期的表达呈负相关；MnCHT3A在A期表达量最高，miR-305-5p在D0-2期表达量最高，两者同样呈负相关关系。推测miR-3049-5p和miR-305-5p可能分别负向调控日本沼虾几丁质降解相关基因MnNAGase和MnCHT3A的表达。
离体双荧光素酶实验结果显示，miR-3049-5pmimic通过结合MnNAGase基因的3UTR，从而极显著下调其上游荧光素酶基因的表达；而miR-3049-5pinhibitor可以抑制了miRNA发挥作用，极显著地提高了荧光素酶基因的表达。说明离体条件下，miR-3049-5p对相应靶基因MnNAGase的表达具有抑制作用；且将结合位点突变后，抑制作用消除。
向日本沼虾体内显微注射miRNAmimic或者miRNAinhibitor来过表达或者抑制相应miRNA的表达，在体水平上进一步验证miR-3049-5p和miR-305-5p对靶基因MnNAGase和MnCHT3A的调控作用。结果表明，miR-3049-5p和miR-305-5p有相似的实验结果：注射miRNAmimic即过表达miRNA后，靶基因的表达量有显著或极显著降低，而注射miRNAinhibitor即抑制miRNA后，靶基因表达量较对照组有极显著升高；相关酶活性的变化趋势与靶基因基本一致。
H-E染色结果显示，C期头胸甲表皮分为3层，由外到内分别为最薄且染色较深的上表皮、嗜碱性较强呈深紫蓝色的外表皮和弱嗜酸性呈粉红色的内表皮。外表皮板层紧密排列，而内表皮板层排列较疏松。注射miRNAmimic过表达miRNA后，内表皮厚度明显增加，而外表皮厚度保持相对稳定。而注射miRNAinhibitor抑制miRNA的表达后，表皮结构出现断裂，但表皮厚度无明显变化。
几丁质荧光染色结果显示，上表皮因不含几丁质成分而显示红色；外表皮和内表皮都显示蓝色且呈现隐约可见的板层结构，说明都是由几丁质-蛋白质微纤维网架构成；但内表皮染色较深，说明内表皮含几丁质较多。注射miRNAmimic或miRNAinhibitor后，表皮结构的变化与H-E染色结果一致，说明无论是增加或是抑制miR-3049-5p和miR-305-5p的表达，都会影响几丁质降解过程，造成日本沼虾的表皮结构特别是内表皮结构发生变化，进而影响了日本沼虾的正常蜕皮过程，证明miR-3049-5p和miR-305-5p及其靶基因MnNAGase和MnCHT3A在日本沼虾几丁质降解过程中确实发挥着重要作用。
综上，本研究通过生物信息学分析、蜕皮周期表达量分析、离体双荧光素酶实验和在体注射实验等实验方法，发现miR-3049-5p和miR-305-5p通过靶向调控MnNAGase和MnCHT3A控制几丁质的降解，从而在转录后水平调控日本沼虾的蜕皮过程，为揭示miRNA介导的几丁质降解机制转录后调节的分子机理提供了重要的科学依据。
为了探究miRNA对MnNAGase和MnCHT3A的调控作用，本文在前期已经获取基因全长和完成SmallRNA深度测序(miRNA-Seq)的基础上，筛选主要在表皮中特异表达的miRNA，利用生物信息学的方法预测和判断miRNA的结合位点；通过实时荧光定量PCR分析miRNA和靶基因在蜕皮周期中的表达变化、离体双荧光素酶验证试验、在体显微注射实验分析预测获得的候选miRNA与其靶基因MnNAGase和MnCHT3A的相互作用，获得的结果如下：
miR-3049-5p与MnNAGase基因、miR-305-5p与MnCHT3A基因存在结合位点，具有潜在结合能力。MnNAGase的表达峰值在D0-2期，而miR-3049-5p的表达峰值在C期，两者的表达量变化情况在整个蜕皮周期的表达呈负相关；MnCHT3A在A期表达量最高，miR-305-5p在D0-2期表达量最高，两者同样呈负相关关系。推测miR-3049-5p和miR-305-5p可能分别负向调控日本沼虾几丁质降解相关基因MnNAGase和MnCHT3A的表达。
离体双荧光素酶实验结果显示，miR-3049-5pmimic通过结合MnNAGase基因的3UTR，从而极显著下调其上游荧光素酶基因的表达；而miR-3049-5pinhibitor可以抑制了miRNA发挥作用，极显著地提高了荧光素酶基因的表达。说明离体条件下，miR-3049-5p对相应靶基因MnNAGase的表达具有抑制作用；且将结合位点突变后，抑制作用消除。
向日本沼虾体内显微注射miRNAmimic或者miRNAinhibitor来过表达或者抑制相应miRNA的表达，在体水平上进一步验证miR-3049-5p和miR-305-5p对靶基因MnNAGase和MnCHT3A的调控作用。结果表明，miR-3049-5p和miR-305-5p有相似的实验结果：注射miRNAmimic即过表达miRNA后，靶基因的表达量有显著或极显著降低，而注射miRNAinhibitor即抑制miRNA后，靶基因表达量较对照组有极显著升高；相关酶活性的变化趋势与靶基因基本一致。
H-E染色结果显示，C期头胸甲表皮分为3层，由外到内分别为最薄且染色较深的上表皮、嗜碱性较强呈深紫蓝色的外表皮和弱嗜酸性呈粉红色的内表皮。外表皮板层紧密排列，而内表皮板层排列较疏松。注射miRNAmimic过表达miRNA后，内表皮厚度明显增加，而外表皮厚度保持相对稳定。而注射miRNAinhibitor抑制miRNA的表达后，表皮结构出现断裂，但表皮厚度无明显变化。
几丁质荧光染色结果显示，上表皮因不含几丁质成分而显示红色；外表皮和内表皮都显示蓝色且呈现隐约可见的板层结构，说明都是由几丁质-蛋白质微纤维网架构成；但内表皮染色较深，说明内表皮含几丁质较多。注射miRNAmimic或miRNAinhibitor后，表皮结构的变化与H-E染色结果一致，说明无论是增加或是抑制miR-3049-5p和miR-305-5p的表达，都会影响几丁质降解过程，造成日本沼虾的表皮结构特别是内表皮结构发生变化，进而影响了日本沼虾的正常蜕皮过程，证明miR-3049-5p和miR-305-5p及其靶基因MnNAGase和MnCHT3A在日本沼虾几丁质降解过程中确实发挥着重要作用。
综上，本研究通过生物信息学分析、蜕皮周期表达量分析、离体双荧光素酶实验和在体注射实验等实验方法，发现miR-3049-5p和miR-305-5p通过靶向调控MnNAGase和MnCHT3A控制几丁质的降解，从而在转录后水平调控日本沼虾的蜕皮过程，为揭示miRNA介导的几丁质降解机制转录后调节的分子机理提供了重要的科学依据。