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血栓是多种心脑血管疾病重要的致病因素之一，一般指血管内或者心脏内血液由正常的流动状态变为凝固状态的现象。由血栓导致的心脑血管疾病和其他多种相关疾病，综合统称为血栓类疾病，对全世界和中国人民的身心安全与健康构成了极大的威胁。血栓类疾病的治疗方法分为手术、抗栓、溶栓，其中最常见的治疗方法是溶栓，所使用的溶栓药物已经有三代的更迭。
枯草杆菌溶栓酶QK-2是一种具有高溶栓活性的蛋白酶，具有溶栓效果突出、成本低廉、结构稳定、有口服潜力等优点，是一种很有潜力的溶栓药物候选品，有待对其进行进一步的结构、功能、药代和临床研究。然而，由于缺乏针对QK-2的高效、快捷、特异、可定量的检测手段，进一步的研究大多无法顺利开展。传统的检测手段大多有特异性不足、复杂耗时或者费用昂贵等缺点，无法满足对QK-2展开快速高效定量检测的需求。
为解决这个问题，本研究建立了针对QK-2的双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测方法。
本研究首先制备了效价为1:64,000的兔抗QK-2多克隆抗体和4株抗QK-2单克隆抗体。经鉴定，单抗亚型均为IgG1，效价均为1:500,000，单抗对QK-2的识别特异性良好，所获得的杂交瘤细胞能够稳定地分泌单抗。
然后对所制得的抗体进行了筛选，使用合适的抗体对构建了双抗体夹心，并在此基础上建立了针对QK-2的ELISA。所建立的ELISA方法，最低检测限为1.160ng/mL，线性检测范围为1.96-250ng/mL，拟合方程为Y=0.2124*X+0.1906(R2=0.9912)，临界值为0.236。经鉴定，该方法在批内和批间试验中的回收率均在95-105%区间内，变异系数均小于5%；在血浆样品中，没有发现其对尿激酶和纳豆激酶的交叉反应。该方法具有良好的的特异性、精确性和重复性。
将建立的ELISA方法应用到药代动力学研究中，对大鼠进行了2、4、8mg/kgQK-2剂量的静脉推注，并对血液中随后各时间点的QK-2浓度进行了持续监测，以此为基础绘制了QK-2的血药浓度-时间曲线，计算出了相应药代动力学参数，构建了QK-2的大鼠静脉推注药代动力学模型。QK-2在大鼠体内的代谢过程符合开放性二室模型，在进入血液后，QK-2迅速形成中央室分布，并迅速分布到周边室进行代谢消除，其消除过程遵循一级动力学。QK-2具有较长的半衰期和平均驻留时间，这可能意味着QK-2在血液中的代谢消除较慢，可以较长时间地发挥溶栓功能。这项研究为将来的QK-2研究和临床应用提供了一些经验。
最后，本研究通过全身主动过敏试验，对QK-2的致敏性进行了初步评价。将建立的C57BL/6小鼠OVA致敏模型作为参考，对小鼠进行了不同剂量和给药方式的QK-2全身主动过敏试验。结果显示，2mgQK-2灌胃刺激未能给小鼠带来致敏反应；0.2mg和0.02mgQK-2注射刺激的小鼠在体温、过敏症状和血清IgE上有所反应，但IgG1浓度和组胺浓度没有发生明显变化；2mgQK-2注射刺激的小鼠在临床表现和血清IgE和IgG1浓度和组胺浓度等指标上均发生了显著变化，与0.05mgOVA刺激的水平相当。对QK-2致敏性的初步评价结果，提示我们QK-2相比于OVA来说，其致敏性相当微弱，大剂量注射才能导致小鼠发生显著过敏反应，低剂量注射使小鼠致敏的表现尚且有待进一步研究，口服QK-2则相对不能明显引起小鼠的过敏反应。
总之，本研究为QK-2的后续研究和血栓类疾病治疗的临床应用提供了一些数据。
枯草杆菌溶栓酶QK-2是一种具有高溶栓活性的蛋白酶，具有溶栓效果突出、成本低廉、结构稳定、有口服潜力等优点，是一种很有潜力的溶栓药物候选品，有待对其进行进一步的结构、功能、药代和临床研究。然而，由于缺乏针对QK-2的高效、快捷、特异、可定量的检测手段，进一步的研究大多无法顺利开展。传统的检测手段大多有特异性不足、复杂耗时或者费用昂贵等缺点，无法满足对QK-2展开快速高效定量检测的需求。
为解决这个问题，本研究建立了针对QK-2的双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测方法。
本研究首先制备了效价为1:64,000的兔抗QK-2多克隆抗体和4株抗QK-2单克隆抗体。经鉴定，单抗亚型均为IgG1，效价均为1:500,000，单抗对QK-2的识别特异性良好，所获得的杂交瘤细胞能够稳定地分泌单抗。
然后对所制得的抗体进行了筛选，使用合适的抗体对构建了双抗体夹心，并在此基础上建立了针对QK-2的ELISA。所建立的ELISA方法，最低检测限为1.160ng/mL，线性检测范围为1.96-250ng/mL，拟合方程为Y=0.2124*X+0.1906(R2=0.9912)，临界值为0.236。经鉴定，该方法在批内和批间试验中的回收率均在95-105%区间内，变异系数均小于5%；在血浆样品中，没有发现其对尿激酶和纳豆激酶的交叉反应。该方法具有良好的的特异性、精确性和重复性。
将建立的ELISA方法应用到药代动力学研究中，对大鼠进行了2、4、8mg/kgQK-2剂量的静脉推注，并对血液中随后各时间点的QK-2浓度进行了持续监测，以此为基础绘制了QK-2的血药浓度-时间曲线，计算出了相应药代动力学参数，构建了QK-2的大鼠静脉推注药代动力学模型。QK-2在大鼠体内的代谢过程符合开放性二室模型，在进入血液后，QK-2迅速形成中央室分布，并迅速分布到周边室进行代谢消除，其消除过程遵循一级动力学。QK-2具有较长的半衰期和平均驻留时间，这可能意味着QK-2在血液中的代谢消除较慢，可以较长时间地发挥溶栓功能。这项研究为将来的QK-2研究和临床应用提供了一些经验。
最后，本研究通过全身主动过敏试验，对QK-2的致敏性进行了初步评价。将建立的C57BL/6小鼠OVA致敏模型作为参考，对小鼠进行了不同剂量和给药方式的QK-2全身主动过敏试验。结果显示，2mgQK-2灌胃刺激未能给小鼠带来致敏反应；0.2mg和0.02mgQK-2注射刺激的小鼠在体温、过敏症状和血清IgE上有所反应，但IgG1浓度和组胺浓度没有发生明显变化；2mgQK-2注射刺激的小鼠在临床表现和血清IgE和IgG1浓度和组胺浓度等指标上均发生了显著变化，与0.05mgOVA刺激的水平相当。对QK-2致敏性的初步评价结果，提示我们QK-2相比于OVA来说，其致敏性相当微弱，大剂量注射才能导致小鼠发生显著过敏反应，低剂量注射使小鼠致敏的表现尚且有待进一步研究，口服QK-2则相对不能明显引起小鼠的过敏反应。
总之，本研究为QK-2的后续研究和血栓类疾病治疗的临床应用提供了一些数据。