【摘 要】
：
AsCas12a和LbCas12a核酸酶在crRNA的介导下，通过识别最佳的TTTVPAM对靶序列进行编辑。除此之外，Cas12a同样会识别含有C的非经典的PAM序列(如CTTV，TCTV，TTCV等)，然而，这种识别可能在非经典的PAM处引起脱靶，并且基于结构而设计的AsCas12a突变体在扩大PAM的识别范围的同时也会增加脱靶效应。因此，本课题旨在自然界中寻找对PAM识别具有差异的Cas12a
论文部分内容阅读
AsCas12a和LbCas12a核酸酶在crRNA的介导下，通过识别最佳的TTTVPAM对靶序列进行编辑。除此之外，Cas12a同样会识别含有C的非经典的PAM序列(如CTTV，TCTV，TTCV等)，然而，这种识别可能在非经典的PAM处引起脱靶，并且基于结构而设计的AsCas12a突变体在扩大PAM的识别范围的同时也会增加脱靶效应。因此，本课题旨在自然界中寻找对PAM识别具有差异的Cas12a蛋白，探究其脱靶效应以及PAM识别的差异性是否会影响脱靶效应。本课题通过序列比对，体外实验，细胞实验，靶向测序，全基因组高通量测序等一系列实验方法从规则粪球菌(Coprococcus eutactus)中鉴定出一种新的具有基因编辑功能的Cas12a，命名为CeCas12a，其编辑效率与AsCas12a，LbCas12a相当。并且，CeCas12a具有更为严格的PAM识别，进而在哺乳动物细胞的基因编辑中体现出更低的脱靶。本研究阐明了对PAM识别严格与否是影响基因编辑脱靶的一个重要影响因素，CeCas12a可作为基础研究和临床治疗中一种新的具有优良特性的基因编辑备选工具。
其他文献
光温敏核不育系水稻(Photoperiod-thermo-sensitive genic male sterile, PTGMS)的花粉育性可在光周期、温度影响下发生明显的转换，研究表明长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)在其育性转换中起重要的调控作用。lncRNAs是一类长度超过200nt的调控性非编码RNA转录本，通过多种机制参与调控植物中多种生物学过程。
基因组测序技术的进步推动了癌症精准医疗的发展，但肿瘤发生的分子机制依然有待深入研究。作为生物体内重要的顺式作用元件，增强子可被反式作用因子结合，进而促进其靶基因的转录。在肿瘤发生过程中，增强子区域的“重编程”是一个普遍发生的现象。目前关于增强子与癌症的研究大都使用细胞作为实验材料，缺乏组织水平的研究。本文通过对乳腺癌模型小鼠以及结直肠癌病人组织的研究，系统地阐述了在这两种癌症中增强子活性变化如何影
天然免疫系统是宿主抵御外界病原微生物入侵的第一道防线。在病原微生物感染的情况下，结构保守的病原微生物分子即病原相关分子模式(pattern recognition molecular patterns, PAMPs)被模式识别受体(pathogen recognition receptors, PRRs)识别。Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)和视黄酸诱导基因蛋白
骨骼肌(skeletal muscle)是机体至关重要的组织，它的形成与更新发生在胚胎及出生后生长发育的任一阶段。骨骼肌分化进程受到转录因子paired-box家族Pax蛋白、肌生成调节因子(myogenic regulatory factors)MRFs蛋白和肌细胞增强因子2(Myocyte enhancer factor-2)家族MEF2蛋白的严格调控。骨骼肌分化异常导致各种肌肉相关疾病如横纹
胆固醇是哺乳动物体内最重要的一类甾醇分子，并且胆固醇在生物体内是受到精密调控的。生物体内的胆固醇在正常情况下会达到一个动态平衡，如果发生了紊乱，就可能会造成一系列的代谢性疾病，如心血管疾病，肥胖，胆结石，肝硬化，甚至肝癌等。 高胆固醇血症是造成一系列心血管疾病的重要致病因素，已经有研究表明，血脂异常有很高的遗传可能性，低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipoprotein Chole
阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)是一种常见于老年人群的神经退行性疾病，其发病原因非常复杂，发病机制尚不明确。淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)级联假说和tau蛋白异常假说是目前最为主流的AD致病假说。Aβ通过其前体蛋白(amyloid-βprecursorprotein，APP)在β-位淀粉样蛋白前体蛋白切割酶1(β-siteAPPcleavingenzyme1，B
自噬是一种进化上非常保守的由溶酶体介导的生物降解过程，对细胞内稳态具有重要的调控作用。自噬过程首先形成双层自噬体膜，然后该双层膜包裹一部分受损细胞器及蛋白聚集体等细胞质成分，将其输送到溶酶体进行降解。在多细胞生物中，自噬作用能够调节多种生理功能，如细胞营养应激反应、细胞命运决定和组织重塑等。自噬起始过程由多种调控因子参与，主要包括由BECN1、ATG14、PIK3R4(VPS15)及PIK3C3(
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)是一种重要的致瘤病毒，在宿主体内存在潜伏感染和再激活裂解复制两相生命周期。KSHV的再激活裂解复制期对于维持病毒在宿主体内的持续性感染和病毒的致瘤过程具有重要作用。病毒的复制和转录激活因子(Replication and transcription activator，RTA)是由KS
低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoproteincholesterol，LDL-c)是造成心血管类疾病的重要因素，低密度脂蛋白受体(LDL receptor，LDLR)介导的LDL内吞是机体清除LDL的主要途径，这一途径在人体胆固醇代谢平衡方面起到重要的调节作用。人类遗传学发现PCSK9(Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin type 9)
在细胞应对如DNA损伤、原癌基因活化或细胞非正常增殖时，p53作为重要的肿瘤抑制因子被迅速激活并诱导下游一系列靶基因的表达，同时触发多个细胞程序，从及时反应如DNA修复和细胞周期停滞到最终命运的决定如细胞死亡(凋亡)和永久性细胞周期停滞(细胞衰老)，使细胞免于恶性增殖。p53对下游基因的调控过程中，有很多p53的协同调节因子通过p53信号通路在癌症发生过程中起着重要作用。但是目前对于p53协同调节