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呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是引起婴幼儿下呼吸道感染的重要病原体，可导致肺炎和支气管炎，严重时导致死亡。老人和免疫系统缺陷的成人也是RSV感染的高危人群。因此，研发安全有效的RSV疫苗是预防RSV感染的主要措施之一。但是，目前尚无针对RSV感染的疫苗上市。二十世纪六十年代，传统技术制备的福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)接种婴幼儿引起的疫苗增强性疾病(Vaccine-enhanced disease，VED)，极大地阻碍了RSV疫苗的发展。因此，深入了解VED的机制对RSV疫苗的研发至关重要。
RSV的F蛋白和G蛋白是制备RSV亚单位疫苗的重要抗原。本课题组前期研究表明，以乙型肝炎病毒核心蛋白为载体，嵌合表达RSVG蛋白中央保守抗原区的病毒样颗粒HBc-tG，在小鼠体内可诱导产生特异性抗体和针对RSV感染的免疫保护，但免疫的小鼠在RSV感染后仍产生了疫苗增强性疾病，表现为过度的Th2型免疫反应和肺组织病理损伤。本研究中，我们构建了IL-35的真核表达质粒以及能够稳定表达IL-35的小鼠肺成纤维细胞系，在细胞水平上研究了IL-35的生物活性。结果显示，IL-35可以抑制炎症因子IL-6和IL-8的表达。以小鼠为模型，研究HBc-tG和IL-35共同免疫小鼠诱导的抗RSV免疫应答。结果显示，HBc-tG和IL-35共同免疫小鼠可以诱导机体产生RSV特异性IgG抗体、IgG1抗体和IgG2a抗体以及中和抗体。免疫小鼠在RSV感染后，检测肺组织RSVN基因拷贝数、肺部反应以及肺组织病理损伤。结果显示，HBc-tG和IL-35共同免疫小鼠在RSV感染4天后，能有效清除小鼠肺组织病毒；IL-35增强了机体Th1型免疫反应，减弱了Th2型免疫反应；肺组织CD4+CD25+Treg细胞比例和IL-10，TGF-β和IL-35细胞因子浓度均显著增加；肺组织切片HE染色显示，IL-35减轻了HBc-tG诱导产生的肺组织病理损伤。
为了在基因水平探讨IL-35减轻由HBc-tG引起的疫苗增强性疾病的机制，采用Illumina技术对小鼠的肺组织进行RNA-seq并应用系统生物学方法对RNA-seq数据进行分析。和正常组小鼠相比，共鉴定出2644个差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)。基于BioGRID数据库中的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络，构建了2644个DEGs的调控网络。根据ClsterONE算法，对差异基因进行模块识别，共筛选得到十二个高影响力模块(high influence modules，HIMs)。应用DAVID对十二个HIMs进行了GO功能富集分析，结果发现HIM10与机体免疫应答功能密切相关。对HBc-tG+pVAX组和HBc-tG+pIL-35组的HIM10进行拓扑学分析，结果显示，Il10是两组中度最大的节点，即网络中与Il10相互作用基因数最多，表明Il10在调节宿主反应中起关键作用。进一步分析发现，IL-35激活了Il10通路中Foxp3的表达，这可能与Treg细胞免疫抑制功能有关。通过荧光定量PCR检测了五个基因(Il10，Tlr9，Cd274，Adgre1和Myd88)的表达水平，结果显示mRNA水平和RNA-seq结果一致，表明RNA-seq数据可靠，可用于后续研究。
我们的研究表明，IL-35可以调节病毒样颗粒HBc-tG诱导平衡的免疫应答,在基因水平上改变了Il10的信号通路，激活了Il10通路中Foxp3的表达，这与Treg细胞的免疫抑制功能密切相关，因此降低了肺部炎症，抑制了肺部病理损伤。我们的结果为深入理解RSV疫苗增强性疾病分子机制和发展RSV感染性疾病的防治策略奠定了重要的理论基础和技术基础。
RSV的F蛋白和G蛋白是制备RSV亚单位疫苗的重要抗原。本课题组前期研究表明，以乙型肝炎病毒核心蛋白为载体，嵌合表达RSVG蛋白中央保守抗原区的病毒样颗粒HBc-tG，在小鼠体内可诱导产生特异性抗体和针对RSV感染的免疫保护，但免疫的小鼠在RSV感染后仍产生了疫苗增强性疾病，表现为过度的Th2型免疫反应和肺组织病理损伤。本研究中，我们构建了IL-35的真核表达质粒以及能够稳定表达IL-35的小鼠肺成纤维细胞系，在细胞水平上研究了IL-35的生物活性。结果显示，IL-35可以抑制炎症因子IL-6和IL-8的表达。以小鼠为模型，研究HBc-tG和IL-35共同免疫小鼠诱导的抗RSV免疫应答。结果显示，HBc-tG和IL-35共同免疫小鼠可以诱导机体产生RSV特异性IgG抗体、IgG1抗体和IgG2a抗体以及中和抗体。免疫小鼠在RSV感染后，检测肺组织RSVN基因拷贝数、肺部反应以及肺组织病理损伤。结果显示，HBc-tG和IL-35共同免疫小鼠在RSV感染4天后，能有效清除小鼠肺组织病毒；IL-35增强了机体Th1型免疫反应，减弱了Th2型免疫反应；肺组织CD4+CD25+Treg细胞比例和IL-10，TGF-β和IL-35细胞因子浓度均显著增加；肺组织切片HE染色显示，IL-35减轻了HBc-tG诱导产生的肺组织病理损伤。
为了在基因水平探讨IL-35减轻由HBc-tG引起的疫苗增强性疾病的机制，采用Illumina技术对小鼠的肺组织进行RNA-seq并应用系统生物学方法对RNA-seq数据进行分析。和正常组小鼠相比，共鉴定出2644个差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)。基于BioGRID数据库中的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络，构建了2644个DEGs的调控网络。根据ClsterONE算法，对差异基因进行模块识别，共筛选得到十二个高影响力模块(high influence modules，HIMs)。应用DAVID对十二个HIMs进行了GO功能富集分析，结果发现HIM10与机体免疫应答功能密切相关。对HBc-tG+pVAX组和HBc-tG+pIL-35组的HIM10进行拓扑学分析，结果显示，Il10是两组中度最大的节点，即网络中与Il10相互作用基因数最多，表明Il10在调节宿主反应中起关键作用。进一步分析发现，IL-35激活了Il10通路中Foxp3的表达，这可能与Treg细胞免疫抑制功能有关。通过荧光定量PCR检测了五个基因(Il10，Tlr9，Cd274，Adgre1和Myd88)的表达水平，结果显示mRNA水平和RNA-seq结果一致，表明RNA-seq数据可靠，可用于后续研究。
我们的研究表明，IL-35可以调节病毒样颗粒HBc-tG诱导平衡的免疫应答,在基因水平上改变了Il10的信号通路，激活了Il10通路中Foxp3的表达，这与Treg细胞的免疫抑制功能密切相关，因此降低了肺部炎症，抑制了肺部病理损伤。我们的结果为深入理解RSV疫苗增强性疾病分子机制和发展RSV感染性疾病的防治策略奠定了重要的理论基础和技术基础。