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目的：
纤维蛋白原（Fibrinogen,Fg）在凝血途径中一个相当重要的组成部分，主要以凝血因子I的形式直接在凝血过程中发挥作用。遗传性纤维蛋白原缺陷症是一种临床发病频率较低的遗传性疾病，常因Fg的三个同源编码基因缺陷导致纤维蛋白原结构和/或功能异常而引起。该病临床呈高度异质性，可表现为出血、血栓形成或者无任何症状。抗凝血酶（Antithrombin,AT）是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，通过灭活活化的凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ，达到抗凝目的。合成AT蛋白的基因SERPINC1位于人类染色体1q23-25上，长约13,480bp，成熟的抗凝血酶是由432个氨基酸构成的糖蛋白。遗传性抗凝血酶缺陷症是常染色体显性遗传，该病可引起血浆中AT活性和/或抗原水平的异常，易导致血栓性疾病。目前遗传性纤维蛋白原缺陷症和遗传性抗凝血酶缺陷症的诊断主要依靠临床实验室出凝血指标检查，缺乏特异性。明确基因突变位点对遗传性纤维蛋白原缺陷症和遗传性抗凝血酶缺陷症的临床诊断、治疗和预防尤为重要，并且有利于对患者出血、血栓形成等的风险进行评估。本文对一个遗传性纤维蛋白原缺陷症和一个遗传性抗凝血酶缺陷症家系进行表型诊断与基因变异分析，初步探讨其发病的遗传学基础。
方法：
（一）研究对象
家系1：先证者，女，30岁，此次因“乳腺小叶增生”入院治疗。术前常规凝血功能检查发现血浆凝血酶时间（thrombin time，TT）和凝血酶原时间（prothrombin time，PT）稍延长，纤维蛋白原活性（Fibrinogen activity,Fg∶C）和纤维蛋白原抗原（Fibrinogen antigen，Fg∶Ag）显著降低，无肝肾功能异常。父母为非近亲结婚。
家系2：先证者，男，21岁，因“反复头痛2天”入院，既往有深静脉血栓形成（Deep vein thrombosis，DVT）史。实验室检查发现抗凝血酶活性（Antithrombin，AT∶A）降低，其他指标均无明显异常。先证者父亲和两位祖父有DVT病史。
（二）研究方法
1.样本采集及处理
征得同意后，采集各先证者及其他成员外周血，以109mmol/L枸橼酸钠1∶9抗凝，4℃3000r/min离心10分钟，取上层血浆2h内完成实验室表型检查；取下层血细胞用于抽提外周血细胞基因组DNA，-40℃保存待测。
2.实验室表型检查
在STAGO全自动血凝分析仪上采用凝固法检测PT、TT、Fg:C和活化部分凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time，APTT)；免疫比浊法检测D-二聚体（D-dimer,D-D）、纤维蛋白（原）降解产物（Fibrinogen degradation product,FDP）；发色底物法检测AT∶A、血浆蛋白C活性（Protein C activity,PC∶A）和纤溶酶原活性（Plasminogen activity,PLG∶A）。在LX20全自动生化分析仪上采用免疫比浊法测定血浆Fg∶Ag和AT∶Ag水平。
3.基因提取检测
应用非离心柱型基因组DNA提取系统提取两名先证者及其家系成员外周血基因组DNA。应用Primier Premier5.0TM软件，以Genbank中对应序列为基础，设计两组引物，分别覆盖Fg基因和AT基因的所有外显子区域及其侧翼序列，以及3＇、5＇端非编码区。在Therml cycler2720扩增仪上进行聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），产物纯化后送上海桑尼生物工程有限公司直接测序，然后与美国国立生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）提供的Fg基因（GenBank M64982、M64983、M10014）、SERPINC1基因（GenBank X68793）序列进行在线比对，寻找基因突变位点，若发现突变位点，则反向测序进行验证。
4.生物信息学分析
利用PolyPhen-2、PROVEAN、SIFT和MutationTaster四个在线生物信息学软件，通过评分结果预测突变氨基酸对整个蛋白质功能的影响；应用多序列比对软件ClustalX-2.1-win将突变氨基酸进行同源物种序列保守性分析；运用Swiss-PdbViewer4.0.1和Pymol软件，基于蛋白数据库（Protein database，PDB）中已知的Fg和AT蛋白结构模型，对突变的蛋白建模进行比对，分析突变前后蛋白质空间结构及分子间作用力的改变。
结果：
1.家系1：先证者PT、TT较正常值均延长，Fg∶C、Fg∶Ag水平显著降低；基因检测分析发现在先证者FGB基因上存在c.425T＞G杂合错义突变，导致纤维蛋白原β链上121位亮氨酸突变为精氨酸（p.Leu121Arg）。其父亲和儿子也存在c.425T＞G杂合错义突变。四个生物信息学软件对p.Leu121Arg突变的预测结果均为致病性；蛋白模型3D分析显示c.425T＞G杂合错义突变使121位氨基酸变为精氨酸，相对于原来的亮氨酸，氨基酸极性发生改变，同时分别与Try117、Met118、Trp125各自新增了一条氢键；蛋白同源性分析显示：在脊椎动物间Leu121高度保守。
2.家系2：先证者和其祖父、叔公、父亲、阿姨及姐姐AT:A均降低为正常值的50%左右，其母亲AT:A水平略有下降至88％。基因检测发现先证者AT基因有两个突变，分别为第2外显子的c.318_319insT（导致p.Asn75stop）杂合插入突变和第5外显子的c.922G＞T（导致p.Gly276Cys）杂合错义突变；其祖父、叔公、父亲、阿姨及姐姐存在c.318_319insT杂合插入突变；其母亲存在c.922G＞T杂合错义突变。四个生物信息学软件对c.922G＞T突变的预测结果均为致病性，突变蛋白模型3D分析显示c.318_319insT突变产生终止密码子（UAA），产生了截短蛋白（p,Asn75stop）；c.922G＞T突变显示Gly276被Cys276取代，引起Ala134和Ser138的空间位阻。
结论：
1.遗传性纤维蛋白原缺陷症家系中，先证者及其父亲和儿子Fg:C与Fg:Ag含量均由不同程度降低，表现为低纤维蛋白原血症；三位家系成员FGB基因均发现第3外显子存在c.425T＞G杂合错义突变，导致p.Leu121Arg杂合错义突变，此突变与该家系Fg水平降低有关。
2.遗传性抗凝血酶缺陷家系中，先证者及部分家系成员AT:A与AT:Ag含量均降低，为Ⅰ型抗凝血酶缺陷症；基因突变分析显示先证者SERPINC1基因2号外显子存在c.318_319insT杂合插入突变，产生截短蛋白（p.Asn75stop），5号外显子存在c.922G＞T杂合错义突变，导致p.Gly276Cys杂合错义突变。p.Asn75stop截短蛋白的产生和p.Gly276Cys杂合错义突变与该家系AT水平降低有关。
3.遗传性纤维蛋白原缺陷症家系中的p.Leu121Arg错义突变和遗传性抗凝血酶缺陷家系中的p.Asn75stop、p.Gly276Cys突变均为国内外首次报道。
纤维蛋白原（Fibrinogen,Fg）在凝血途径中一个相当重要的组成部分，主要以凝血因子I的形式直接在凝血过程中发挥作用。遗传性纤维蛋白原缺陷症是一种临床发病频率较低的遗传性疾病，常因Fg的三个同源编码基因缺陷导致纤维蛋白原结构和/或功能异常而引起。该病临床呈高度异质性，可表现为出血、血栓形成或者无任何症状。抗凝血酶（Antithrombin,AT）是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，通过灭活活化的凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ，达到抗凝目的。合成AT蛋白的基因SERPINC1位于人类染色体1q23-25上，长约13,480bp，成熟的抗凝血酶是由432个氨基酸构成的糖蛋白。遗传性抗凝血酶缺陷症是常染色体显性遗传，该病可引起血浆中AT活性和/或抗原水平的异常，易导致血栓性疾病。目前遗传性纤维蛋白原缺陷症和遗传性抗凝血酶缺陷症的诊断主要依靠临床实验室出凝血指标检查，缺乏特异性。明确基因突变位点对遗传性纤维蛋白原缺陷症和遗传性抗凝血酶缺陷症的临床诊断、治疗和预防尤为重要，并且有利于对患者出血、血栓形成等的风险进行评估。本文对一个遗传性纤维蛋白原缺陷症和一个遗传性抗凝血酶缺陷症家系进行表型诊断与基因变异分析，初步探讨其发病的遗传学基础。
方法：
（一）研究对象
家系1：先证者，女，30岁，此次因“乳腺小叶增生”入院治疗。术前常规凝血功能检查发现血浆凝血酶时间（thrombin time，TT）和凝血酶原时间（prothrombin time，PT）稍延长，纤维蛋白原活性（Fibrinogen activity,Fg∶C）和纤维蛋白原抗原（Fibrinogen antigen，Fg∶Ag）显著降低，无肝肾功能异常。父母为非近亲结婚。
家系2：先证者，男，21岁，因“反复头痛2天”入院，既往有深静脉血栓形成（Deep vein thrombosis，DVT）史。实验室检查发现抗凝血酶活性（Antithrombin，AT∶A）降低，其他指标均无明显异常。先证者父亲和两位祖父有DVT病史。
（二）研究方法
1.样本采集及处理
征得同意后，采集各先证者及其他成员外周血，以109mmol/L枸橼酸钠1∶9抗凝，4℃3000r/min离心10分钟，取上层血浆2h内完成实验室表型检查；取下层血细胞用于抽提外周血细胞基因组DNA，-40℃保存待测。
2.实验室表型检查
在STAGO全自动血凝分析仪上采用凝固法检测PT、TT、Fg:C和活化部分凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time，APTT)；免疫比浊法检测D-二聚体（D-dimer,D-D）、纤维蛋白（原）降解产物（Fibrinogen degradation product,FDP）；发色底物法检测AT∶A、血浆蛋白C活性（Protein C activity,PC∶A）和纤溶酶原活性（Plasminogen activity,PLG∶A）。在LX20全自动生化分析仪上采用免疫比浊法测定血浆Fg∶Ag和AT∶Ag水平。
3.基因提取检测
应用非离心柱型基因组DNA提取系统提取两名先证者及其家系成员外周血基因组DNA。应用Primier Premier5.0TM软件，以Genbank中对应序列为基础，设计两组引物，分别覆盖Fg基因和AT基因的所有外显子区域及其侧翼序列，以及3＇、5＇端非编码区。在Therml cycler2720扩增仪上进行聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），产物纯化后送上海桑尼生物工程有限公司直接测序，然后与美国国立生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）提供的Fg基因（GenBank M64982、M64983、M10014）、SERPINC1基因（GenBank X68793）序列进行在线比对，寻找基因突变位点，若发现突变位点，则反向测序进行验证。
4.生物信息学分析
利用PolyPhen-2、PROVEAN、SIFT和MutationTaster四个在线生物信息学软件，通过评分结果预测突变氨基酸对整个蛋白质功能的影响；应用多序列比对软件ClustalX-2.1-win将突变氨基酸进行同源物种序列保守性分析；运用Swiss-PdbViewer4.0.1和Pymol软件，基于蛋白数据库（Protein database，PDB）中已知的Fg和AT蛋白结构模型，对突变的蛋白建模进行比对，分析突变前后蛋白质空间结构及分子间作用力的改变。
结果：
1.家系1：先证者PT、TT较正常值均延长，Fg∶C、Fg∶Ag水平显著降低；基因检测分析发现在先证者FGB基因上存在c.425T＞G杂合错义突变，导致纤维蛋白原β链上121位亮氨酸突变为精氨酸（p.Leu121Arg）。其父亲和儿子也存在c.425T＞G杂合错义突变。四个生物信息学软件对p.Leu121Arg突变的预测结果均为致病性；蛋白模型3D分析显示c.425T＞G杂合错义突变使121位氨基酸变为精氨酸，相对于原来的亮氨酸，氨基酸极性发生改变，同时分别与Try117、Met118、Trp125各自新增了一条氢键；蛋白同源性分析显示：在脊椎动物间Leu121高度保守。
2.家系2：先证者和其祖父、叔公、父亲、阿姨及姐姐AT:A均降低为正常值的50%左右，其母亲AT:A水平略有下降至88％。基因检测发现先证者AT基因有两个突变，分别为第2外显子的c.318_319insT（导致p.Asn75stop）杂合插入突变和第5外显子的c.922G＞T（导致p.Gly276Cys）杂合错义突变；其祖父、叔公、父亲、阿姨及姐姐存在c.318_319insT杂合插入突变；其母亲存在c.922G＞T杂合错义突变。四个生物信息学软件对c.922G＞T突变的预测结果均为致病性，突变蛋白模型3D分析显示c.318_319insT突变产生终止密码子（UAA），产生了截短蛋白（p,Asn75stop）；c.922G＞T突变显示Gly276被Cys276取代，引起Ala134和Ser138的空间位阻。
结论：
1.遗传性纤维蛋白原缺陷症家系中，先证者及其父亲和儿子Fg:C与Fg:Ag含量均由不同程度降低，表现为低纤维蛋白原血症；三位家系成员FGB基因均发现第3外显子存在c.425T＞G杂合错义突变，导致p.Leu121Arg杂合错义突变，此突变与该家系Fg水平降低有关。
2.遗传性抗凝血酶缺陷家系中，先证者及部分家系成员AT:A与AT:Ag含量均降低，为Ⅰ型抗凝血酶缺陷症；基因突变分析显示先证者SERPINC1基因2号外显子存在c.318_319insT杂合插入突变，产生截短蛋白（p.Asn75stop），5号外显子存在c.922G＞T杂合错义突变，导致p.Gly276Cys杂合错义突变。p.Asn75stop截短蛋白的产生和p.Gly276Cys杂合错义突变与该家系AT水平降低有关。
3.遗传性纤维蛋白原缺陷症家系中的p.Leu121Arg错义突变和遗传性抗凝血酶缺陷家系中的p.Asn75stop、p.Gly276Cys突变均为国内外首次报道。