【摘 要】
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(目的)本文旨在克隆苏禽黄鸡Nanog 基因启动子,并构建含有双荧光素酶报告基因的表达载体进行启动子活性分析,找出该基因启动子的核心调控区；探索甲基化抑制剂5-Azadc(5-aza-2′-deoxycytidine)或曲古抑菌素(Trichostatin A,TSA)对Nanog 基因启动活性及其ESC 体外培养条件下多能性维持的影响,为初步阐明Nanog 基因的表达调控机制提供理论依据。(方法
【出 处】
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中国畜牧兽医学会家禽学分会第十七次全国家禽学术研讨会
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(目的)本文旨在克隆苏禽黄鸡Nanog 基因启动子,并构建含有双荧光素酶报告基因的表达载体进行启动子活性分析,找出该基因启动子的核心调控区；探索甲基化抑制剂5-Azadc(5-aza-2′-deoxycytidine)或曲古抑菌素(Trichostatin A,TSA)对Nanog 基因启动活性及其ESC 体外培养条件下多能性维持的影响,为初步阐明Nanog 基因的表达调控机制提供理论依据。(方法)利用生物学软件对Nanog基因启动子区进行分析,PCR 扩增Nanog 基因不同长度片段的启动子序列,定向克隆至pGL3-basic 载体和pEGFP-N1 构建重组载体；将重组载体转染DF-1 细胞后48h 收集蛋白,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,确定基本转录调控区；将重组载体转染DF-1 细胞后添加5-Azadc 或TSA 对Nanog 基因进行诱导表达,并通过双荧光素酶报告基因检测系统分析其对Nanog 基因启动子活性的影响。选取生长至第三代的ESC,培养基中添加最适浓度的5-Azadc 和TSA,每隔2 天观察细胞分析其对ESC 体外多能性维持的影响,并对诱导至第十天的细胞进行间接免疫荧光检测。(结果)成功克隆苏禽黄鸡Nanog 基因启动子3 个不同片段,分别构建了3 个片段的双荧光素酶报告基因表达载体pGL3/3049、pGL3/1967、pGL3/988 和pEGFP-N1/3049；双荧光素酶活性检测结果显示,pGL3/1967 活性最强；分别添加或者联合添加5-Azadc 和TSA 均可使Nanog 基因的转录活性增强；5-Azadc 和TSA 诱导对ESC 体外培养条件下多能性维持的影响结果显示,诱导6 天后,对照组细胞大量分化,细胞克隆无法维持,而5-Azadc 和TSA 诱导组克隆明显,5-Azadc+TSA 联合诱导组细胞克隆数量显著多于对照组；诱导至第十天,对照组细胞完全分化,没有细胞克隆,而诱导组存在大量细胞克隆,联合诱导组克隆数量显著多于其他三组；SSEA-1 间接免疫荧光结果显示,对照组没有明显的ESC 克隆,而5-Azadc 组和联合诱导组细胞克隆明显,进一步表明5-Azadc 和TSA 可有效的通过提高Nanog 基因的表达而维持鸡ESC 在体外培养过程中的多能性。
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