【摘 要】
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[目的]确定苏秦黄鸡Stra8 基因启动子的主要调控区域和预测调控元件的结合位点,探索用他米巴洛丁(Am80)或曲古抑菌素(TSA)诱导对Stra8 启动子活性的调控作用。[方法]将苏秦黄鸡Stra8 基因5侧翼系列缺失片段插入到pGL3-basic 载体构建重组质粒并转染DF-1 和GC-1 细胞,通过检测双荧光素酶活性和预测启动子区域调控元件的结合位点,选取适宜的启动子片段并构建其重组质粒St
【机 构】
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扬州大学动物科学与技术学院,江苏省动物繁育与分子设计重点实验室,扬州225009
【出 处】
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中国畜牧兽医学会家禽学分会第十七次全国家禽学术研讨会
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[目的]确定苏秦黄鸡Stra8 基因启动子的主要调控区域和预测调控元件的结合位点,探索用他米巴洛丁(Am80)或曲古抑菌素(TSA)诱导对Stra8 启动子活性的调控作用。[方法]将苏秦黄鸡Stra8 基因5侧翼系列缺失片段插入到pGL3-basic 载体构建重组质粒并转染DF-1 和GC-1 细胞,通过检测双荧光素酶活性和预测启动子区域调控元件的结合位点,选取适宜的启动子片段并构建其重组质粒Stra8-EGFP；将Am 80 和TSA 分别按一定的浓度梯度诱导经转染细胞,进行荧光素酶活性检测以筛选Am 80 和TSA 的最佳诱导浓度；用最适剂量的Am 80 和TSA 分别单独或联合诱导转染重组质粒Stra8-EGFP 的DF-1 细胞,通过观察绿色荧光表达程度检测Am 80 和TSA 在细胞水平对Stra8 启动活性的影响；选取生长至第三代的ESCs,培养基中添加最适浓度的Am 80 和TSA,每隔2 天观察细胞分析其对ESCs 体外分化的影响,并对诱导至第十天的细胞进行间接免疫荧光检测和荧光定量诱导不同天数生殖标记基因的变化。[结果]双荧光素酶活性检测结果显示,鸡Stra8基因启动子区-1055～+54 片段的活性较强,且含有RARα、RXRα和RARβ的结合位点；使用不同浓度的Am80 和TSA 对其进行诱导后发现二者分别在浓度为10-5mol/L 和10-6mol/L 时相对荧光素酶活性值最高,说明此浓度是Am80 和TSA 最佳诱导浓度；分别采用Am 80 和TSA 单独或联合对转染的细胞进行诱导后发现,Am 80 和TSA 协同作用的荧光素酶活性最高；重组质粒Stra8-EGFP转染DF-1 细胞后,用最佳浓度的Am 80 和TSA 联合诱导可见最强绿色荧光程度；诱导至第10 天的细胞能够表达integrinβ1 蛋白,表明Am80 和TSA 可促进ESCs 向SSCs 分化。对诱导不同天数的细胞进行生殖特异标记基因检测,结果表明Am80 和TSA 能够促进ESCs 向PGCs 和SSCs 样细胞分化,二者联合诱导组SSCs 样细胞生成效率显著高于对照组或单独诱导组。[结论]成功分析了鸡Stra8 基因启动子的活性和调控元件的结合位点,确定Am 80 和TSA 联合诱导可显著提高Stra8基因启动活性,促进ESCs 向PGCs 和SSsC 样细胞分化。该结果为通过提高Stra8 的表达量而促进雄性生殖细胞生成的效率提供参考依据。
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