【摘 要】
：
(目的)本研究探讨了CRISPR/Cas 系统在鸡物种中的应用并通过CRISPR/Cas 介导基因敲除和过表达的方法验证从RNA-seq 测序过程中筛选的特异基因XM_001233327.1 的功能.(方法)采用流式细胞分选法获得纯度较高的ESC(Embryonic stem cells,ESCs)、PGC(Primordial germ cells,PGCs)和SSC(Spermatogonia
【机 构】
：
扬州大学动物科学与技术学院,江苏省动物繁育与分子设计重点实验室,扬州,225009
【出 处】
：
中国畜牧兽医学会家禽学分会第十七次全国家禽学术研讨会
论文部分内容阅读
(目的)本研究探讨了CRISPR/Cas 系统在鸡物种中的应用并通过CRISPR/Cas 介导基因敲除和过表达的方法验证从RNA-seq 测序过程中筛选的特异基因XM_001233327.1 的功能.(方法)采用流式细胞分选法获得纯度较高的ESC(Embryonic stem cells,ESCs)、PGC(Primordial germ cells,PGCs)和SSC(Spermatogonial Stem cells,SSCs),提取RNA 进行转录组水平测序,通过生物信息学分析和GO 功能分析筛选鸡雄性生殖细胞分化过程中生殖细胞特异表达基因；针对筛选的特异表达基因构建Cas9 基因敲除载体,转染状态良好的ESC 并进行鸡胚注射,通过SSA 活性检测、T7E1酶切检测以及TA 克隆检测CRISPR/Cas 系统在鸡物种上的应用情况,分别构建该基因的基因敲除载体和过表达载体在体内和体外同时验证该基因的功能.(结果)RNA-seq 测序结果表明：在雄性生殖细胞分化过程中有2 个未知的转录本在PGC 中特异表达；构建的3 号Cas9 基因敲除载体SSA活性比对照组提高2 倍,将3 号载体转染鸡DF-1 细胞后T7E1 酶切检测和TA 克隆检测表明：该系统在鸡成纤维细胞介导基因XM_001233327.1 敲除效率为27％,3 号载体注射鸡胚上也能够有效的介导基因的敲除；在抑制细胞分化的因子培养条件下通过CRISPR/Cas 介导基因敲除后ESC 与对照组相比Oct4 基因并未出现显著变化,而过表达该基因时细胞在培养过程中Oct4 基因与对照组相比显著下调,Cvh 基因的表达量显著的上调；基因敲除载体和过表达载体转染ESC 后进行体外诱导实验过程中过表达组的类胚体出现的较多且出现生殖样细胞,而空白组和敲除组则没有显著差异.对照组中的Cvh 表达未出现显著性的变化；过表达组中Cvh 表达有明显的上调趋势,说明细胞开始向PGCs 方向分化,敲除组中Cvh 表达有明显的下降趋势,说明候选基因在敲出过后,细胞无法向PGCs 方向分化,而且与正常的RA 诱导组相比ESC 分化为PGC 和SSC 的数量显著减少；而过表达该基因时PGC 和SSC 产生的数量与对照组相比有显著的增加.(结论)本实验结果表明CRISPR/Cas 系统能够在鸡物种上能够有效的介导基因敲除,通过RNA-seq 筛选的未知转录本XM_001233327.1 基因为PGC 特异表达基因,敲除该基因后体外和体内都能有效的抑制PGC 的生成.
其他文献
[目的]本试验通过二因子二次回归正交旋转组合设计,以能量和粗蛋白作为两个试验因子,旨在研究22-42 日龄肉仔鸡能量和粗蛋白水平的最佳组合效应.[方法]试验选取健康、体重接近的22 日龄科宝肉鸡480 只,随机分为12 个组,每组4 个重复,每个重复10 只鸡,公母各半,其中1-8 组为试验组,9-12 组为中心组(即零水平组),试验期为21天.分别以能量和粗蛋白水平为自变量,以生产性能各项指标作
Introduction Mitochondrion is power house of the cell; its an important organelle involving in energy homeostasis.Change in mitochondrial function may lead to metabolic disorders.For example,mitochond
[目的]本试验研究了相同SID(standardized ileal digestible,标准回肠可消化)氨基酸(AA)模式(Ile：Met+Cys：Thr：Trp：Val：Lys=80：91：70：21：88：100)下,日粮能量(ME)浓度与蛋白质(CP)水平对初产海兰灰蛋鸡生产性能、蛋品质、血液与氮排放参数及温室气体排出的影响.[方法]试验选用648羽20 周龄健康鸡只,随机分为6 处理组
[目的]绿壳蛋鸡因产绿壳蛋而闻名，其营养丰富而逐渐受到人们的关注和欢迎.饲粮氨基酸的不平衡或超量添加不仅可引起蛋鸡生产性能的降低和养殖成本的升高，而且可导致环境的污染.赖氨酸在蛋鸡的玉米-豆粕型饲粮中作为第二限制性氨基酸，其主要生理功能是参与蛋白质的合成.而目前关于绿壳蛋鸡氨基酸需要的研究仅限于对蛋氨酸的需要.本试验研究了不同饲粮赖氨酸水平对绿壳蛋种鸡生产性能、氨基酸消化率、血清生化指标及血清激素
[目的]本试验旨在研究饲粮不同色氨酸(Trp)水平对29-38 周龄黄羽肉鸡父母代种鸡繁殖性能、血液生化指标、肠黏膜免疫与蛋白代谢相关基因表达及其后代肉鸡生长性能的影响,探讨该阶段适宜Trp 供给量.[方法]试验选用29wk 岭南黄羽肉鸡父母代种母鸡780 只,根据体重分为5 个处理,每处理6 个重复,每重复26 只鸡.处理1 为玉米-玉米蛋白粉型基础日粮(Trp 水平为0.11％),处理2、3、
铁是动物必需的微量元素,在饲粮配制时需要以饲料添加剂的形式补充,但饲料加工过程中掺入的铁常使饲粮含铁量过高,导致动物采食量和生长速度降低.近年来的研究发现,饲粮高铁可能通过调控十二指肠粘膜上转运铁的二价金属转运蛋白DMT1和膜铁转运蛋白FPN1也影响其它二价金属的转运.[目的]本研究目的在于研究饲粮高铁对肉仔鸡十二指肠DMT1和FPN1基因表达及锰吸收转运的影响.[方法]360只1日龄罗斯肉公雏按
[目的]蛋鸭养殖与鸭蛋加工为我国传统的优势产业,颜色鲜亮、个大、出油多的咸鸭蛋黄一直以来是人们喜爱的食品.但是由于我国蛋鸭养殖逐渐转向全圈养的集约化养殖,而富含类胡萝卜素的玉米资源紧缺,导致蛋黄色泽变浅而影响鸭蛋的商品价值.蛋黄着色研究以鸡蛋为对象始于20 世纪初,主要体现在鲜蛋,对咸蛋没有报道.合成色素因着色效果好、成本低廉等优点被广泛用于养殖业,但研究发现某些合成色素有对人体有害,人们更倾向于
本文旨在探究鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中糖代谢相关基因以及信号通路的调控机制,以期为体外诱导生成雄性生殖细胞提供依据.采用流式分选的方法获取高纯度的鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)、原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGC)和精原干细胞(Spermatogoniastemcell,SSC),分别提取细胞总RNA,采用DNA Microa
类胡萝卜素在动物机体内具有多种重要功能,在畜牧生产中日益受到重视,但到目前为止,没有证据证明动物自身可生物合成类胡萝卜素.所有动物体内的类胡萝卜素均是通过食物链最终来源于植物和微生物.日粮中的类胡萝卜素在小肠被吸收进入体内后,参与机体代谢利用过程.所以类胡萝卜素的酶解是机体利用类胡萝卜素的关键步骤,目前研究已表明动物体内主要有两种酶氧化分解类胡萝卜素,在肠道、肝脏组织中BCMO1(β-胡萝卜素-1
Introduction In mammals,insulin resistance (IR) is essential to the development of non-alcoholic fatty liverdisease (NAFLD) ,and endoplasmic reticulum stress (ERS) plays an important role in IR.There