【摘 要】
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目的 建立一种稳定、高效的原代小鼠肝细胞分离、纯化与培养方法。方法 在传统的两步胶原酶灌流法的基础上进行5个方面的优化和改进,包括将门静脉正向灌流改为下腔静脉逆向灌流、将持续灌注改为间断灌注、灌注胶原酶时将门静脉近心端夹闭、根据小鼠体重严格限制胶原酶的消化时间以及将分离的肝细胞悬液进行Percoll单密度梯度低速离心纯化。肝细胞活力和得率用台盼蓝染色法进行检测。将分离后的肝细胞分别采用单层胶原培养
【机 构】
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中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所化学污染与健康重点实验室,北京100050
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目的 建立一种稳定、高效的原代小鼠肝细胞分离、纯化与培养方法。方法 在传统的两步胶原酶灌流法的基础上进行5个方面的优化和改进,包括将门静脉正向灌流改为下腔静脉逆向灌流、将持续灌注改为间断灌注、灌注胶原酶时将门静脉近心端夹闭、根据小鼠体重严格限制胶原酶的消化时间以及将分离的肝细胞悬液进行Percoll单密度梯度低速离心纯化。肝细胞活力和得率用台盼蓝染色法进行检测。将分离后的肝细胞分别采用单层胶原培养法和"三明治"夹层体外培养法进行培养,并观察不同时期(24 h,48 h,72 h,5d,7d,10d,14d)小鼠肝细胞的形态变化。结果 新鲜分离的原代小鼠肝细胞经Percoll低速离心纯化后,活率达到90％±5％,纯度达到95％±4％,产量达到9×105～1×106g体质量。绝大部分原代小鼠肝细胞在体外培养3h后贴壁生长,换无血清培养基体外培养24h后90％以上肝细胞呈典型的肝细胞形态特征(肝细胞为多边形,排列整齐,界限清晰,胞体较大,胞核呈圆形,大部分有双核以上的细胞核)。单层胶原培养的肝细胞,出现肝板样结构时间较短,4～5d后细胞开始不断脱落、死亡；夹层培养的肝细胞可相对较长时间(＞10 d)维持肝板样结构。结论 优化的肝细胞分离和纯化方法能更为稳定、有效获得高活力和高纯度原代小鼠肝细胞,用"三明治"夹层培养法能更为有效维持肝板样结构。
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