【摘 要】
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本实验的目的在于建立多重PCR方法同时检测鲜切哈密瓜中的单增李斯特菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157∶H7.实验根据单增李斯特菌hlyA基因、沙门氏菌的inuA基因、大肠杆菌O157：H7的wzy基因设计三对特异性引物,然后对多重PCR反应体系中的引物浓度、退火温度、Mg2+浓度、DNTPs浓度等指标进行了优化,并确定适宜的多重PCR反应体系及反应条件.最终其反应体系25μL中10×PCR buffe
【机 构】
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大连民族大学生命科学学院,生物化学工程国家民委-教育部重点实验室 辽宁大连116600 大连民族大
【出 处】
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中国食品科学技术学会第十二届年会暨第八届中美食品业高层论坛
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本实验的目的在于建立多重PCR方法同时检测鲜切哈密瓜中的单增李斯特菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157∶H7.实验根据单增李斯特菌hlyA基因、沙门氏菌的inuA基因、大肠杆菌O157：H7的wzy基因设计三对特异性引物,然后对多重PCR反应体系中的引物浓度、退火温度、Mg2+浓度、DNTPs浓度等指标进行了优化,并确定适宜的多重PCR反应体系及反应条件.最终其反应体系25μL中10×PCR buffer 2.5μL,MgCl2(25 mmol/L)3μL,DNTPs(2.5mmol/L)2μL, 沙门氏菌终引物浓度0.2 μmol/L,大肠杆菌O157∶H7引物终浓度0.2μmol/L,单增李斯特菌引物终浓度0.4 μmol/L,DNA模板各lμL,Taq酶(5U/L)0.3μL,加ddH2O补充至25μL；反应程序为：95℃预变性3 min,94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,进行32个循环,最后72℃终延伸10min.然后,通过引物特异性试验及灵敏性实验,证明该方法具有较好的特异性,且在3个小时内完成检测,最低检出限为104cfu/mL,在鲜切哈密瓜中最低检出限为105 cfu/mL.最终初步建立了简便、快速、灵敏性高且能同步检测食品中沙门菌、大肠杆菌O157∶H7和单核细胞增生性李斯特菌的三重PCR方法.
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