【摘 要】
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为了研究半胱氨酸蛋白酶在镰形扇头蜱唾液腺凋亡过程中的作用机制,本研究首先构建了镰形扇头蜱唾液腺吸血前后cDNA文库,对唾液腺转录组进行测序,分别获得10760(未吸血)和
【机 构】
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中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫病重点实验室,上海 200241
【出 处】
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中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会
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为了研究半胱氨酸蛋白酶在镰形扇头蜱唾液腺凋亡过程中的作用机制,本研究首先构建了镰形扇头蜱唾液腺吸血前后cDNA文库,对唾液腺转录组进行测序,分别获得10760(未吸血)和10928(半饱血)个ESTs；根据差异基因表达分析,共有1179个上调基因和574个下调基因,根据数据库序列注释,筛选出若干半胱氨酸蛋白酶相关基因,根据基因克隆筛选及蛋白纯化情况,最终选取cathepsin B(CATB),cathepsin L(CATL),caspase-1(CASP 1),caspase-8(CASP8),autophagy-related 4B(ATG4B),autophagy-related gene 4D(ATG4D)六个半胱氨酸蛋白酶基因作为研究对象。通过构建表达载体,共获得5个半胱氨酸蛋白酶重组蛋白(caspase-8未能表达)并对其酶活性进行测定,通过Westen blot技术,鉴定了这5种蛋白酶在成蜱天然状态下的形态,对其特性进行分析。通过实时定量PCR检测,分析了6种半胱氨酸蛋白酶分别在未吸血、半饱血和饱血蜱的不同发育阶段(卵、幼蜱、若蜱和成蜱)及成蜱不同组织器官中转录水平,发现几乎所有蛋白酶均在饱血后达到最大转录水平。利用RNAi技术,在若蜱中对caspase-1进行沉默,发现caspase-8,ATG4B及ATG4D均受到严重抑制,差异非常显著,推测四者之间可能存在级联互作反应或调节机制,但未对若蜱的生存发育造成影响。本研究将继续在若蜱中进行其他蛋白酶的干扰实验,以明确阐明6种蛋白酶之间的互作调节关系。此外,本研究还将通过干扰caspase-1和caspase-8,探究半胱氨酸蛋白酶在蜱唾液腺凋亡过程中的作用机制,证实镰形扇头蜱唾液腺退化由凋亡引起,并尝试阐明在此过程中半胱氨酸蛋白酶的作用机制,为了解蜱的唾液腺生理学特征和发现新的防治技术提供基础。
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