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摘要：目的 采用三罐组动态逆流的方法对当归中阿魏酸的提取工艺进行优化。方法 采用高效液相色谱法测定当归中阿魏酸含量，以阿魏酸为指标成分，采用全面试验考察提取时间和加水倍量对提取效率的影响。结果 当归水溶性成分阿魏酸的优化提取工艺为：加10倍量水，单次提取时间为20 min。结论 三罐组动态逆流的方法提取当归中阿魏酸的工艺可靠，提取效率高，节省能源。
关键词：当归；三罐组动态逆流；阿魏酸
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.026
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）08-0096-03
Study on Extraction Process of Ferulic Acid from Angelicae Sinensis Radix with Technology of Three Can Group Dynamic Countercurrent SONG Xiao-chun， LIU Xiao-xia， WEI Shu-chang， LIN Fang-yuan， WANG Ji-long （Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）
Abstract：Objective To optimize technology of three can group dynamic countercurrent extraction process of ferulic acid from Angelicae Sinensis Radix. Methods The content of ferulic acid was determined by HPLC. With content of ferulic acid as index， comprehensive test was used to investigate effect of extraction solvent and extraction time on extraction efficiency. Results The optimum process parameters were as follows：extraction solvent with 10 times of water；20 minutes for each extraction time. Conclusion The process which uses method of three can group of dynamic countercurrent extraction of ferulic acid from Angelicae Sinensis Radix is reliable， highly efficient and energy saving.
Key words：Angelicae Sinensis Radix；technology of three can group dynamic countercurrent；ferulic acid
基金项目：国家自然科学基金（81060345）
通讯作者：魏舒畅，E-mail：wshch006@163.com
当归为甘肃省道地药材，主产于岷县，为伞形科植物当归Angelica sinensis （Oliv.） Diels的干燥根，其性温，味甘、辛，归肝、心、脾经，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功能，用于血虚萎黄、眩晕心悸、月经不调等病症[1-2]。当归的药效成分主要为挥发油和水溶性成分[3]，其水溶性成分主要为阿魏酸、烟酸、尿嘧啶及多糖等，有研究表明当归水溶性成分具有增强心肌血液供应、缓解心肌缺血的作用[4]。
中药传统提取方法中，药材与溶剂中的有效成分在接近平衡时的浓度差小，导致提取时间长、提取率低[5]。罐组动态逆流提取技术主要利用药材与溶媒两相的浓度梯度差，逐级将药材中有效成分扩散至起始浓度相对较低的套提溶液中，从而达到最大限度转移物料中溶解成分的目的[6-9]。本研究对已提取过挥发油的当归药渣采用三罐组动态逆流提取法进行再次提取，有利于增加提取推动力，加快提取速率，减少溶剂用量，减小浓缩能耗，降低生产成本。同时，对当归药渣的再提取可提高资源利用率。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪（600泵，2487双波长吸光度检测器，Empower色谱工作站），纯水制备仪（成都唐氏康科技发展有限公司），BP211电子天平（Sartorius塞多利斯科学仪器有限公司），101A-1型干燥箱（上海市实验仪器总厂），DZF-6051型真空干燥箱（上海益恒科技有限公司），B型玻璃仪器气流烘干器（英峪仪器厂），RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）， KQ-250型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号11773-200613），乙腈和甲醇均为色谱纯，已提取挥发油的当归药材颗粒（粒度10～20目），其他试剂均为分析纯，水为纯水。
2 方法与结果
2.1 阿魏酸含量测定
2.1.1 对照品溶液的制备 取经真空干燥12 h以上的阿魏酸对照品适量，精密称定，置50 mL棕色容量瓶中，用70%甲醇溶解并稀释至刻度，配成0.092 mg/mL的对照品溶液，置0～4 ℃冰箱中贮存，备用。
2.1.2 供试品溶液的制备 取当归水提取浸膏粉（过20目筛）约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇15 mL，超声（250 W，40 kHz）5 min溶解后定容至25 mL容量瓶中。用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，置0～4 ℃冰箱中贮存，备用。 2.1.3 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，0.45 μm）；预柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×12.5 mm）；流动相：乙腈-0.085%磷酸（17∶83）；流速：1.0 mL/min；检测波长：316 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。此色谱条件下，阿魏酸可与当归其他水溶性组分达到较好分离，且峰形较好。以阿魏酸计理论塔板数N>1500[1]。
2.2 三罐组动态逆流提取工艺的优化
采用三罐组的模式（见图1）：第1罐的3次提取为第1阶段——梯度形成阶段，即提取3次，每次均加入新溶媒（纯水），得到提取液A1、A2、A3，收集提取液A1；然后开始第2阶段——逆流提取阶段，提取液A2作为第2罐第1次提取的溶媒，得提取液B1并收集；提取液A3作为第2罐第2次提取的溶媒，得提取液B2；提取液B2作为第3罐第1次提取的溶媒，得提取液C1并收集；依次循环提取。每罐的第3次提取均加入纯溶媒（纯水）。
采用纯水为溶剂，每罐称取当归药材500 g，按图1的动态逆流提取模式进行提取。因素水平设置见表1。采用全面试验，以阿魏酸含量为检测指标，安排及结果见表2。经全面试验研究可知，提取时间和加水量对当归药材的提取效率均有明显影响。从表2可直观看出，当单次提取时间为20 min、总加水量为10倍时，所提取出的药液中阿魏酸含量最高。故最终确定提取工艺单次提取时间为20 min，总加水量为10倍。
2.3 验证试验
按最优工艺条件提取3份当归提油药渣各500 g，考察工艺的稳定性，试验结果见表3。可见，优化提取工艺所得阿魏酸含量高于工艺筛选中的任一组，且结果比较接近，表明工艺基本稳定。
2.4 水提取药渣中残留阿魏酸的测定
取“2.3”项提取后的药渣3份，置热风循环烘箱中65 ℃干燥至含水量6%以下。采用药典方法，取各干燥药渣，加70%甲醇回流30 min并定容至20 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液测定[1]，见表4。
3 讨论
当归药材主要含挥发油和水溶性成分，由于这2类成分的极性相差较大，无法做到同时高效提取，使以当归为原料的新产品开发受到影响。鉴于目前中药制药企业已实现了当归挥发油的超临界高效萃取，因此，本研究以已提取过挥发油的当归药渣为原料，进一步对其水提工艺进行研究。
在提取工艺条件的筛选中，评价指标的选择很重要。阿魏酸作为当归水溶性部位的主要有效成分，与其他水溶性小分子成分烟酸、尿嘧啶、腺嘌呤等的溶解性相似，均可溶于热水中。有文献表明，在经超临界萃取挥发油后的当归药渣中仍有大部分阿魏酸未被提取[10]。故本研究选择阿魏酸作为工艺评价指标，不但可以考察阿魏酸的提取情况，在一定程度上还可反映当归其他水溶性小分子成分的提取情况。可见，用阿魏酸作为评价指标所得水提取工艺条件比较可靠。将本工艺水提后的当归药渣干燥后，再用药典方法测定剩余的阿魏酸发现，药渣中残留阿魏酸不足0.01%，表明阿魏酸已基本提取完全。
药材粒度的减小有利于缩短提取时间和提高提取率，有文献表明超临界萃取当归挥发油的时药材粒度应不大于10目[11]。但药材粒度的进一步减小会导致水提取物中杂质增多、固液分离困难等问题。本研究所用药材为工业提取挥发油后的当归药渣，其粒度为10～20目，因此，在工艺优化时不再考察药材粒度对提取效果的影响。
在逆流提取过程中，提取罐内维持微沸状态可使药材在溶媒中有一定幅度的翻滚，达到搅拌提取液的作用，有利于加快有效成分的溶出速率。本研究采用罐内提取液微沸状态下的温度为最佳，因此，在工艺优化时不再考察提取温度对提取效果的影响。
本研究通过三罐组动态逆流提取技术对已提取挥发油的当归药材颗粒进行提取，所得工艺的总提取时间只有60 min，溶剂总用量仅为药材质量的10倍，与普通单罐水回流提取相比，不仅提取时间短，而且溶剂的循环套用使总用量减少。该工艺在保证提取率的前提下，可有效提高生产效率、减少提取及浓缩环节的能量损耗，有利于工业化生产的实施。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：124-125.
[2] 李曦，张丽宏，王晓晓，等.当归化学成分及药理作用研究进展[J].中药材，2013，36（6）：1023-1026.
[3] 张敏，胡坪，罗国安，等.当归水溶性成分HPLC指纹图谱研究[J].中成药，2007，29（5）：628-630.
[4] 贺玉琢.当归水溶性提取物对5-FU诱导性贫血的改善作用[J].国际中医中药杂志，2006，28（6）：364.
[5] 蒋伟，王长虹，王峥涛.当归提取物的制备工艺及其质量控制[J].华西药学杂志，2010，25（1）：87-89.
[6] 谢志鹏，刘雪松，陈勇，等.动态罐组式逆流提取技术在中药生产中的应用研究进展[J].中国中药杂志，2007，32（10）：884-887.
[7] 罗喜荣，苑天红，余德顺，等.罐组式动态逆流提取当归油的工艺研究[J].时珍国医国药，2011，22（10）：2443-2444.
[8] 李兴奎，傅冬梅.动态逆流提取技术在中药制剂工艺中的应用（综述）[C]//中国药学会.2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集.天津，2010：3.
[9] 季艳艳，常新全，赵润怀，等.罐组式动态逆流提取技术及其在中药提取中的应用[J].中国现代中药，2006，8（12）：27-30.
[10] 刘丹，刘超英，韩建伟.超临界萃取当归挥发油及阿魏酸正交试验研究[J].中国药师，2008，11（12）：1438-1440.
[11] 岳红坤，贾会珍，王俊.基于超临界CO2萃取技术的当归中挥发油提取工艺研究[J].安徽农业科学，2010，38（14）：7318-7320，7333.
（收稿日期：2014-10-17；编辑：陈静）
关键词：当归；三罐组动态逆流；阿魏酸
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.026
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）08-0096-03
Study on Extraction Process of Ferulic Acid from Angelicae Sinensis Radix with Technology of Three Can Group Dynamic Countercurrent SONG Xiao-chun， LIU Xiao-xia， WEI Shu-chang， LIN Fang-yuan， WANG Ji-long （Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）
Abstract：Objective To optimize technology of three can group dynamic countercurrent extraction process of ferulic acid from Angelicae Sinensis Radix. Methods The content of ferulic acid was determined by HPLC. With content of ferulic acid as index， comprehensive test was used to investigate effect of extraction solvent and extraction time on extraction efficiency. Results The optimum process parameters were as follows：extraction solvent with 10 times of water；20 minutes for each extraction time. Conclusion The process which uses method of three can group of dynamic countercurrent extraction of ferulic acid from Angelicae Sinensis Radix is reliable， highly efficient and energy saving.
Key words：Angelicae Sinensis Radix；technology of three can group dynamic countercurrent；ferulic acid
基金项目：国家自然科学基金（81060345）
通讯作者：魏舒畅，E-mail：wshch006@163.com
当归为甘肃省道地药材，主产于岷县，为伞形科植物当归Angelica sinensis （Oliv.） Diels的干燥根，其性温，味甘、辛，归肝、心、脾经，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功能，用于血虚萎黄、眩晕心悸、月经不调等病症[1-2]。当归的药效成分主要为挥发油和水溶性成分[3]，其水溶性成分主要为阿魏酸、烟酸、尿嘧啶及多糖等，有研究表明当归水溶性成分具有增强心肌血液供应、缓解心肌缺血的作用[4]。
中药传统提取方法中，药材与溶剂中的有效成分在接近平衡时的浓度差小，导致提取时间长、提取率低[5]。罐组动态逆流提取技术主要利用药材与溶媒两相的浓度梯度差，逐级将药材中有效成分扩散至起始浓度相对较低的套提溶液中，从而达到最大限度转移物料中溶解成分的目的[6-9]。本研究对已提取过挥发油的当归药渣采用三罐组动态逆流提取法进行再次提取，有利于增加提取推动力，加快提取速率，减少溶剂用量，减小浓缩能耗，降低生产成本。同时，对当归药渣的再提取可提高资源利用率。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪（600泵，2487双波长吸光度检测器，Empower色谱工作站），纯水制备仪（成都唐氏康科技发展有限公司），BP211电子天平（Sartorius塞多利斯科学仪器有限公司），101A-1型干燥箱（上海市实验仪器总厂），DZF-6051型真空干燥箱（上海益恒科技有限公司），B型玻璃仪器气流烘干器（英峪仪器厂），RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）， KQ-250型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号11773-200613），乙腈和甲醇均为色谱纯，已提取挥发油的当归药材颗粒（粒度10～20目），其他试剂均为分析纯，水为纯水。
2 方法与结果
2.1 阿魏酸含量测定
2.1.1 对照品溶液的制备 取经真空干燥12 h以上的阿魏酸对照品适量，精密称定，置50 mL棕色容量瓶中，用70%甲醇溶解并稀释至刻度，配成0.092 mg/mL的对照品溶液，置0～4 ℃冰箱中贮存，备用。
2.1.2 供试品溶液的制备 取当归水提取浸膏粉（过20目筛）约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇15 mL，超声（250 W，40 kHz）5 min溶解后定容至25 mL容量瓶中。用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，置0～4 ℃冰箱中贮存，备用。 2.1.3 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，0.45 μm）；预柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×12.5 mm）；流动相：乙腈-0.085%磷酸（17∶83）；流速：1.0 mL/min；检测波长：316 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。此色谱条件下，阿魏酸可与当归其他水溶性组分达到较好分离，且峰形较好。以阿魏酸计理论塔板数N>1500[1]。
2.2 三罐组动态逆流提取工艺的优化
采用三罐组的模式（见图1）：第1罐的3次提取为第1阶段——梯度形成阶段，即提取3次，每次均加入新溶媒（纯水），得到提取液A1、A2、A3，收集提取液A1；然后开始第2阶段——逆流提取阶段，提取液A2作为第2罐第1次提取的溶媒，得提取液B1并收集；提取液A3作为第2罐第2次提取的溶媒，得提取液B2；提取液B2作为第3罐第1次提取的溶媒，得提取液C1并收集；依次循环提取。每罐的第3次提取均加入纯溶媒（纯水）。
采用纯水为溶剂，每罐称取当归药材500 g，按图1的动态逆流提取模式进行提取。因素水平设置见表1。采用全面试验，以阿魏酸含量为检测指标，安排及结果见表2。经全面试验研究可知，提取时间和加水量对当归药材的提取效率均有明显影响。从表2可直观看出，当单次提取时间为20 min、总加水量为10倍时，所提取出的药液中阿魏酸含量最高。故最终确定提取工艺单次提取时间为20 min，总加水量为10倍。
2.3 验证试验
按最优工艺条件提取3份当归提油药渣各500 g，考察工艺的稳定性，试验结果见表3。可见，优化提取工艺所得阿魏酸含量高于工艺筛选中的任一组，且结果比较接近，表明工艺基本稳定。
2.4 水提取药渣中残留阿魏酸的测定
取“2.3”项提取后的药渣3份，置热风循环烘箱中65 ℃干燥至含水量6%以下。采用药典方法，取各干燥药渣，加70%甲醇回流30 min并定容至20 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液测定[1]，见表4。
3 讨论
当归药材主要含挥发油和水溶性成分，由于这2类成分的极性相差较大，无法做到同时高效提取，使以当归为原料的新产品开发受到影响。鉴于目前中药制药企业已实现了当归挥发油的超临界高效萃取，因此，本研究以已提取过挥发油的当归药渣为原料，进一步对其水提工艺进行研究。
在提取工艺条件的筛选中，评价指标的选择很重要。阿魏酸作为当归水溶性部位的主要有效成分，与其他水溶性小分子成分烟酸、尿嘧啶、腺嘌呤等的溶解性相似，均可溶于热水中。有文献表明，在经超临界萃取挥发油后的当归药渣中仍有大部分阿魏酸未被提取[10]。故本研究选择阿魏酸作为工艺评价指标，不但可以考察阿魏酸的提取情况，在一定程度上还可反映当归其他水溶性小分子成分的提取情况。可见，用阿魏酸作为评价指标所得水提取工艺条件比较可靠。将本工艺水提后的当归药渣干燥后，再用药典方法测定剩余的阿魏酸发现，药渣中残留阿魏酸不足0.01%，表明阿魏酸已基本提取完全。
药材粒度的减小有利于缩短提取时间和提高提取率，有文献表明超临界萃取当归挥发油的时药材粒度应不大于10目[11]。但药材粒度的进一步减小会导致水提取物中杂质增多、固液分离困难等问题。本研究所用药材为工业提取挥发油后的当归药渣，其粒度为10～20目，因此，在工艺优化时不再考察药材粒度对提取效果的影响。
在逆流提取过程中，提取罐内维持微沸状态可使药材在溶媒中有一定幅度的翻滚，达到搅拌提取液的作用，有利于加快有效成分的溶出速率。本研究采用罐内提取液微沸状态下的温度为最佳，因此，在工艺优化时不再考察提取温度对提取效果的影响。
本研究通过三罐组动态逆流提取技术对已提取挥发油的当归药材颗粒进行提取，所得工艺的总提取时间只有60 min，溶剂总用量仅为药材质量的10倍，与普通单罐水回流提取相比，不仅提取时间短，而且溶剂的循环套用使总用量减少。该工艺在保证提取率的前提下，可有效提高生产效率、减少提取及浓缩环节的能量损耗，有利于工业化生产的实施。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：124-125.
[2] 李曦，张丽宏，王晓晓，等.当归化学成分及药理作用研究进展[J].中药材，2013，36（6）：1023-1026.
[3] 张敏，胡坪，罗国安，等.当归水溶性成分HPLC指纹图谱研究[J].中成药，2007，29（5）：628-630.
[4] 贺玉琢.当归水溶性提取物对5-FU诱导性贫血的改善作用[J].国际中医中药杂志，2006，28（6）：364.
[5] 蒋伟，王长虹，王峥涛.当归提取物的制备工艺及其质量控制[J].华西药学杂志，2010，25（1）：87-89.
[6] 谢志鹏，刘雪松，陈勇，等.动态罐组式逆流提取技术在中药生产中的应用研究进展[J].中国中药杂志，2007，32（10）：884-887.
[7] 罗喜荣，苑天红，余德顺，等.罐组式动态逆流提取当归油的工艺研究[J].时珍国医国药，2011，22（10）：2443-2444.
[8] 李兴奎，傅冬梅.动态逆流提取技术在中药制剂工艺中的应用（综述）[C]//中国药学会.2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集.天津，2010：3.
[9] 季艳艳，常新全，赵润怀，等.罐组式动态逆流提取技术及其在中药提取中的应用[J].中国现代中药，2006，8（12）：27-30.
[10] 刘丹，刘超英，韩建伟.超临界萃取当归挥发油及阿魏酸正交试验研究[J].中国药师，2008，11（12）：1438-1440.
[11] 岳红坤，贾会珍，王俊.基于超临界CO2萃取技术的当归中挥发油提取工艺研究[J].安徽农业科学，2010，38（14）：7318-7320，7333.
（收稿日期：2014-10-17；编辑：陈静）