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摘要：目的 通过体外实验探讨丙肝合剂抑制不同基因型丙型肝炎病毒（HCV）复制子基因表达的机制。方法 建立不同基因型HCV复制子细胞模型，按基因型不同分为HCV 1b组、HCV 2a组和J6/JFH1组，不同浓度丙肝合剂干预负载复制子的Huh7.5.1细胞48 h后，收集细胞裂解液，进行荧光素酶活性测定，MTT法检测细胞毒性。选择IFN-2α和DMSO分别作为阳性对照和阴性对照以排除实验误差。结果 3组荧光素酶活性呈剂量依赖性下降，3组比较差异有统计学意义（P<0.05）。多重比较显示，HCV 2a组荧光素酶活性显著低于HCV 1b组和J6/JFH1组（P<0.05）。MTT实验结果显示，丙肝合剂浓度达到0.2 g/mL时，细胞存活率超过99%。结论 丙肝合剂能部分抑制不同基因型HCV结构基因的转录，对HCV 2a复制子抑制作用最强，丙肝合剂达到有效抑制作用的浓度为0.1 g/mL。
关键词：丙肝合剂；丙型肝炎病毒；复制子系统；基因表达
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.021
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）08-0077-04
Effects of Hepatitis C Mixture on RNA Expression of Different Genotypic HCV Replicons LI Jing-tao1， WEI Hai-liang1， XI Qi1， LIU Ya-zhu1， YAN Shu-guang2， HUI Yi2， SONG Chun-rong1， LI Ri-xiang1， CHANG Zhan-jie1 （1.The Hospital Affiliated to Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712000， China；2.Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712000， China）
Abstract：Objective To investigate the inhibition mechanism of Hepatitis C Mixture for RNA expression of different genotypic HCV replicons in vitro. Methods Different genotypic HCV replicon cell models were established. According to the disparity of genotypes， they were divided into three groups which named HCV 1b， HCV 2a and J6/JFH1. The Huh7.5.1 cell colonies which contain HCV replicon RNA were treated with various concentrations of Hepatitis C Mixture for 48 h. Then the luciferase activity and cytotoxicity of cell colonieswere detected. MTT method was used to detect cytotoxicity. IFN-2α and DMSO were selected as positive and negative control for eliminating the experiment errors. Results Luciferase activities of three groups showed a dose dependent decrease. Luciferase activities of three groups were significant different （P<0.05）. Multiple comparisons were performed and showed the luciferase activity of HCV 2a group was lower than those in HCV 1b and J6/JFH1 groups （P<0.05）. The results of MTT showed that when cells were treated with 0.2 g/mL of Hepatitis C Mixture， cellular survival rate was higher over 99%. Conclusion Hepatitis C Mixture could partly inhibit the RNA expression of different genotypic HCV replicons in vitro， especially the HCV 2a replicon. The optimal inhibitory concentrations of Hepatitis C Mixture is 0.1 g/mL.
Key words：Hepatitis C Mixture；hepatitis C virus；replicon system；RNA expression
基金项目：陕西省教育厅专项科研计划（2013JK0815）；咸阳市科学技术研究计划（2014K04-04）；陕西中医学院自然科学创新基金（14XJZR08）；陕西中医学院附属医院科研课题（2014-34）
丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是导致慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一，根据HCV病毒株核苷酸的同源性差异，目前可将其分为6个基因型及其不同亚型[1]。目前，临床上应用中药和中成药治疗丙型病毒性肝炎较普遍，在保肝、抗病毒方面均取得了一定效果[2-3]。但传统中医大多采用复方制剂进行临床治疗，对相关作用机理很难阐述清楚[4]。丙肝合剂是我院肝病科有效验方，前期临床研究结果显示，丙肝合剂具有一定的抗HCV作用[5]。为进一步明确丙肝合剂抗HCV的作用机制，本研究利用不同基因型HCV复制子系统，体外研究丙肝合剂对HCV复制子基因表达的抑制作用，为中药治疗丙型病毒性肝炎研究提供新的思路和方法。 1 实验材料
1.1 细胞株
Huh7.5.1细胞株来自南方医科大学南方医院肝病中心实验室。
1.2 药物
丙肝合剂由黄芪、党参、白术、灵芝、丹参、枳壳等组成，陕西中医药大学附属医院药剂科提供。药物分别按照比例称重、混合，水煎2次，每次30 min，过滤、浓缩至每克含原药材8 g，冻干粉密封，4 ℃冰箱保存，使用时100 ℃水溶解，配置成0.5、1.0 g/mL浓度的药液。
1.3 主要试剂与仪器
限制性内切酶ScaⅠ和荧光素酶检测试剂盒，Promega公司；酚-氯仿-异戊醇（体积比25∶24∶1）及lipofectamine 2000，Invitrogen公司；DMEM和FBS，GIBICO公司；MEGAscript T7 kit，Ambion公司；胰酶、EDTA和G418，Sigma公司；DNA marker和蛋白酶K，Takara公司；RNA marker，NEB公司。RNeasy Mini Kit，QIAgen公司；去DNA酶及RNA酶耗材，Axygen公司，可处理的试剂均经DEPC水或去DNA酶及RNA酶处理；HCV1b、2a和J6/JFH1复制子（1b/2a嵌合）均来自南方医科大学肝病中心实验室。GeneAmp PCR system 9700（美国Applied Biosystems），低温高速离心机（Hema 德国），Genios Pro型Tecan酶标仪（美国Tecan公司），普通光学显微镜（日本Olympus公司），Nikon倒置光学显微镜（日本Nikon公司），CO2恒温培养箱（美国Forma Scientific公司），Milli-Q超纯水器（美国Millipore公司）。
2 实验方法
2.1 复制子质粒体外转录、纯化与转染
HCV复制子质粒体外单酶切线性化，纯化回收后，采用MEGAscript T7 kit试剂盒体外转录HCV RNA， QIAgen纯化试剂盒进行纯化，定量。采用lipofectamine 2000，将转录的HCV RNA分别转染Huh7.5.1细胞系。
2.2 复制子瞬时复制效率检测
体外转录的HCV RNA转染Huh7.5.1细胞，转染4、24、48、72 h后收集细胞裂解液，检测荧光素酶活性。
2.3 RT-PCR检测细胞中HCV NS5A
筛选得到的阳性细胞株重新接种6孔板，待细胞长满后，RNeasy Mini Kit试剂盒提取细胞总RNA， RT-PCR检测HCV NS5A片段，RT-PCR反应条件和引物采用已建立的方法[6]。
2.4 HCV复制子RNA表达
将负载重组HCV复制子的Huh7.5.1阳性克隆细胞以2×104/孔的密度接种至24孔板中，加入DMEM完全培养基培养，当细胞长到满度为60%时，用倍比稀释的丙肝合剂处理细胞48 h，进行荧光素酶活性测定，细胞上清RNA测定，绘制体外药物抗病毒的剂量-效应和时间-效应曲线。为排除实验误差，设立空白对照、阴性对照（DMSO）和阳性对照（IFN-2α）。
2.5 细胞毒性试验
将HCV复制子转染的Huh7.5.1细胞接种至96孔板，设丙肝合剂和DMSO对照组，进行MTT实验，在酶标仪570 nm处检测吸光度。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用卡方检验、t检验和析因设计资料的方差分析。对每个浓度药物干预Huh7.5.1的结果采用单因素方差检验，先进行Levene方差齐性检验，整体比较时方差齐同F检验，方差不齐近似F检验Welch法，多重比较时方差齐同LSD法，方差不齐Dunnett'T3法。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 HCV复制子系统的建立
不同基因型HCV复制子RNA转染Huh7.5.1细胞，转染4、24、48、72 h后检测荧光素酶活性值，设定4 h的荧光素酶活性值为1，以24、48、72 h的荧光素酶活性值与该值的比值反映瞬时复制效率，见图1。转染72 h时细胞RT-PCR扩增HCV NS5A基因全长，电泳结果见图2。
4.2 丙肝合剂对HCV复制子基因表达的影响
以不同浓度的丙肝合剂（0.001、0.01、0.1 g/mL）处理HCV复制子细胞48 h后，收集细胞，测定荧光素酶活性来检测不同浓度丙肝合剂对HCV复制的抑制效果。设定0 g/mL的荧光素酶活性值为1，以其他浓度的荧光素酶活性值与该值的比值反映复制效率，见图3。为排除实验误差，在进行丙肝合剂倍比稀释干预不同基因型HCV复制子细胞时，均选择IFN-2α 50 U作为阳性药物进行对照，48 h后荧光素酶活性均降低50%，阴性对照（DMSO），荧光素酶活性无明显下降。
3组间比较采用析因设计资料的方差分析进行显著性检验，结果显示，不同组间差异显著（P<0.05），不同药物浓度间差异显著（P<0.01），见表1。
丙肝合剂0.1 g/mL干预时，3组整体比较，P<0.05，整体上均数差异显著。进一步多重比较采用LSD法，HCV 1b组与HCV 2a组间比较差异显著（P<0.05），HCV 2a组与J6/JFH1组间比较差异显著（P<0.05），而HCV 1b组和J6/JFH1组比较差异无统计学意义（P>0.05），见图4。
4.3 丙肝合剂的细胞毒性
以不同浓度的丙肝合剂（0.2、0.4、0.6、0.8、1 g/mL）处理Huh7.5.1细胞72 h后，进行MTT实验。丙肝合剂的细胞毒性随药物浓度的增加而增大，细胞存活率依次为99.98%、88.65%、76.33%、47.46%、23.82%。
5 讨论
HCV复制子带有新霉素磷酸转移酶（neor）基因作为筛选标志、虫荧光素酶（Luc）基因作为报告基因，可在细胞培养中稳定、高效地复制表达，并可检测HCV亚基因组，可用于HCV小分子抗病毒药物的筛选及HCV亚基因组RNA和非结构蛋白表达的研究[4，6]。本研究采用不同基因型的HCV 1b、HCV 2a和J6/JFH1复制子系统，可用于中草药及其提取物抗病毒药物筛选和相关机制研究。
本研究通过将不同基因型的HCV复制子重组体转染Huh7.5.1细胞系，不同浓度的丙肝合剂加入Huh7.5.1细胞中，采用RT-PCR和荧光定量检测Huh7.5.1细胞中HCV基因表达情况。结果显示，不同浓度的丙肝合剂处理HCV复制子细胞后，3组荧光素酶活性呈现剂量依赖性的下降，反映出丙肝合剂对HCV复制的抑制作用呈剂量依赖性增加，其中丙肝合剂对HCV 2a复制子RNA的抑制作用最强，用0.1 g/mL浓度干预时，HCV 2a复制子RNA复制率被抑制约50%，而3组整体比较和多重比较的结果显示，HCV 2a组的病毒量显著低于HCV 1b和J6/JFH1组，其他2组差异无统计学意义。说明丙肝合剂对HCV 2a复制子RNA的抑制作用最强，其次为J6/JFH1，然后是HCV 1b。MTT实验结果显示，丙肝合剂的细胞毒性虽然随着药物浓度增大而增大，但当培养72 h后，丙肝合剂的浓度达到0.2 g/mL 时，干预Huh7.5.1细胞72 h，细胞存活率超过99%。
总之，本研究表明，丙肝合剂对HCV基因表达的抑制作用显示，随着药物浓度的增加，HCV基因的转录水平下降，从而说明丙肝合剂能部分抑制HCV结构基因
关键词：丙肝合剂；丙型肝炎病毒；复制子系统；基因表达
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.021
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）08-0077-04
Effects of Hepatitis C Mixture on RNA Expression of Different Genotypic HCV Replicons LI Jing-tao1， WEI Hai-liang1， XI Qi1， LIU Ya-zhu1， YAN Shu-guang2， HUI Yi2， SONG Chun-rong1， LI Ri-xiang1， CHANG Zhan-jie1 （1.The Hospital Affiliated to Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712000， China；2.Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712000， China）
Abstract：Objective To investigate the inhibition mechanism of Hepatitis C Mixture for RNA expression of different genotypic HCV replicons in vitro. Methods Different genotypic HCV replicon cell models were established. According to the disparity of genotypes， they were divided into three groups which named HCV 1b， HCV 2a and J6/JFH1. The Huh7.5.1 cell colonies which contain HCV replicon RNA were treated with various concentrations of Hepatitis C Mixture for 48 h. Then the luciferase activity and cytotoxicity of cell colonieswere detected. MTT method was used to detect cytotoxicity. IFN-2α and DMSO were selected as positive and negative control for eliminating the experiment errors. Results Luciferase activities of three groups showed a dose dependent decrease. Luciferase activities of three groups were significant different （P<0.05）. Multiple comparisons were performed and showed the luciferase activity of HCV 2a group was lower than those in HCV 1b and J6/JFH1 groups （P<0.05）. The results of MTT showed that when cells were treated with 0.2 g/mL of Hepatitis C Mixture， cellular survival rate was higher over 99%. Conclusion Hepatitis C Mixture could partly inhibit the RNA expression of different genotypic HCV replicons in vitro， especially the HCV 2a replicon. The optimal inhibitory concentrations of Hepatitis C Mixture is 0.1 g/mL.
Key words：Hepatitis C Mixture；hepatitis C virus；replicon system；RNA expression
基金项目：陕西省教育厅专项科研计划（2013JK0815）；咸阳市科学技术研究计划（2014K04-04）；陕西中医学院自然科学创新基金（14XJZR08）；陕西中医学院附属医院科研课题（2014-34）
丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是导致慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一，根据HCV病毒株核苷酸的同源性差异，目前可将其分为6个基因型及其不同亚型[1]。目前，临床上应用中药和中成药治疗丙型病毒性肝炎较普遍，在保肝、抗病毒方面均取得了一定效果[2-3]。但传统中医大多采用复方制剂进行临床治疗，对相关作用机理很难阐述清楚[4]。丙肝合剂是我院肝病科有效验方，前期临床研究结果显示，丙肝合剂具有一定的抗HCV作用[5]。为进一步明确丙肝合剂抗HCV的作用机制，本研究利用不同基因型HCV复制子系统，体外研究丙肝合剂对HCV复制子基因表达的抑制作用，为中药治疗丙型病毒性肝炎研究提供新的思路和方法。 1 实验材料
1.1 细胞株
Huh7.5.1细胞株来自南方医科大学南方医院肝病中心实验室。
1.2 药物
丙肝合剂由黄芪、党参、白术、灵芝、丹参、枳壳等组成，陕西中医药大学附属医院药剂科提供。药物分别按照比例称重、混合，水煎2次，每次30 min，过滤、浓缩至每克含原药材8 g，冻干粉密封，4 ℃冰箱保存，使用时100 ℃水溶解，配置成0.5、1.0 g/mL浓度的药液。
1.3 主要试剂与仪器
限制性内切酶ScaⅠ和荧光素酶检测试剂盒，Promega公司；酚-氯仿-异戊醇（体积比25∶24∶1）及lipofectamine 2000，Invitrogen公司；DMEM和FBS，GIBICO公司；MEGAscript T7 kit，Ambion公司；胰酶、EDTA和G418，Sigma公司；DNA marker和蛋白酶K，Takara公司；RNA marker，NEB公司。RNeasy Mini Kit，QIAgen公司；去DNA酶及RNA酶耗材，Axygen公司，可处理的试剂均经DEPC水或去DNA酶及RNA酶处理；HCV1b、2a和J6/JFH1复制子（1b/2a嵌合）均来自南方医科大学肝病中心实验室。GeneAmp PCR system 9700（美国Applied Biosystems），低温高速离心机（Hema 德国），Genios Pro型Tecan酶标仪（美国Tecan公司），普通光学显微镜（日本Olympus公司），Nikon倒置光学显微镜（日本Nikon公司），CO2恒温培养箱（美国Forma Scientific公司），Milli-Q超纯水器（美国Millipore公司）。
2 实验方法
2.1 复制子质粒体外转录、纯化与转染
HCV复制子质粒体外单酶切线性化，纯化回收后，采用MEGAscript T7 kit试剂盒体外转录HCV RNA， QIAgen纯化试剂盒进行纯化，定量。采用lipofectamine 2000，将转录的HCV RNA分别转染Huh7.5.1细胞系。
2.2 复制子瞬时复制效率检测
体外转录的HCV RNA转染Huh7.5.1细胞，转染4、24、48、72 h后收集细胞裂解液，检测荧光素酶活性。
2.3 RT-PCR检测细胞中HCV NS5A
筛选得到的阳性细胞株重新接种6孔板，待细胞长满后，RNeasy Mini Kit试剂盒提取细胞总RNA， RT-PCR检测HCV NS5A片段，RT-PCR反应条件和引物采用已建立的方法[6]。
2.4 HCV复制子RNA表达
将负载重组HCV复制子的Huh7.5.1阳性克隆细胞以2×104/孔的密度接种至24孔板中，加入DMEM完全培养基培养，当细胞长到满度为60%时，用倍比稀释的丙肝合剂处理细胞48 h，进行荧光素酶活性测定，细胞上清RNA测定，绘制体外药物抗病毒的剂量-效应和时间-效应曲线。为排除实验误差，设立空白对照、阴性对照（DMSO）和阳性对照（IFN-2α）。
2.5 细胞毒性试验
将HCV复制子转染的Huh7.5.1细胞接种至96孔板，设丙肝合剂和DMSO对照组，进行MTT实验，在酶标仪570 nm处检测吸光度。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用卡方检验、t检验和析因设计资料的方差分析。对每个浓度药物干预Huh7.5.1的结果采用单因素方差检验，先进行Levene方差齐性检验，整体比较时方差齐同F检验，方差不齐近似F检验Welch法，多重比较时方差齐同LSD法，方差不齐Dunnett'T3法。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 HCV复制子系统的建立
不同基因型HCV复制子RNA转染Huh7.5.1细胞，转染4、24、48、72 h后检测荧光素酶活性值，设定4 h的荧光素酶活性值为1，以24、48、72 h的荧光素酶活性值与该值的比值反映瞬时复制效率，见图1。转染72 h时细胞RT-PCR扩增HCV NS5A基因全长，电泳结果见图2。
4.2 丙肝合剂对HCV复制子基因表达的影响
以不同浓度的丙肝合剂（0.001、0.01、0.1 g/mL）处理HCV复制子细胞48 h后，收集细胞，测定荧光素酶活性来检测不同浓度丙肝合剂对HCV复制的抑制效果。设定0 g/mL的荧光素酶活性值为1，以其他浓度的荧光素酶活性值与该值的比值反映复制效率，见图3。为排除实验误差，在进行丙肝合剂倍比稀释干预不同基因型HCV复制子细胞时，均选择IFN-2α 50 U作为阳性药物进行对照，48 h后荧光素酶活性均降低50%，阴性对照（DMSO），荧光素酶活性无明显下降。
3组间比较采用析因设计资料的方差分析进行显著性检验，结果显示，不同组间差异显著（P<0.05），不同药物浓度间差异显著（P<0.01），见表1。
丙肝合剂0.1 g/mL干预时，3组整体比较，P<0.05，整体上均数差异显著。进一步多重比较采用LSD法，HCV 1b组与HCV 2a组间比较差异显著（P<0.05），HCV 2a组与J6/JFH1组间比较差异显著（P<0.05），而HCV 1b组和J6/JFH1组比较差异无统计学意义（P>0.05），见图4。
4.3 丙肝合剂的细胞毒性
以不同浓度的丙肝合剂（0.2、0.4、0.6、0.8、1 g/mL）处理Huh7.5.1细胞72 h后，进行MTT实验。丙肝合剂的细胞毒性随药物浓度的增加而增大，细胞存活率依次为99.98%、88.65%、76.33%、47.46%、23.82%。
5 讨论
HCV复制子带有新霉素磷酸转移酶（neor）基因作为筛选标志、虫荧光素酶（Luc）基因作为报告基因，可在细胞培养中稳定、高效地复制表达，并可检测HCV亚基因组，可用于HCV小分子抗病毒药物的筛选及HCV亚基因组RNA和非结构蛋白表达的研究[4，6]。本研究采用不同基因型的HCV 1b、HCV 2a和J6/JFH1复制子系统，可用于中草药及其提取物抗病毒药物筛选和相关机制研究。
本研究通过将不同基因型的HCV复制子重组体转染Huh7.5.1细胞系，不同浓度的丙肝合剂加入Huh7.5.1细胞中，采用RT-PCR和荧光定量检测Huh7.5.1细胞中HCV基因表达情况。结果显示，不同浓度的丙肝合剂处理HCV复制子细胞后，3组荧光素酶活性呈现剂量依赖性的下降，反映出丙肝合剂对HCV复制的抑制作用呈剂量依赖性增加，其中丙肝合剂对HCV 2a复制子RNA的抑制作用最强，用0.1 g/mL浓度干预时，HCV 2a复制子RNA复制率被抑制约50%，而3组整体比较和多重比较的结果显示，HCV 2a组的病毒量显著低于HCV 1b和J6/JFH1组，其他2组差异无统计学意义。说明丙肝合剂对HCV 2a复制子RNA的抑制作用最强，其次为J6/JFH1，然后是HCV 1b。MTT实验结果显示，丙肝合剂的细胞毒性虽然随着药物浓度增大而增大，但当培养72 h后，丙肝合剂的浓度达到0.2 g/mL 时，干预Huh7.5.1细胞72 h，细胞存活率超过99%。
总之，本研究表明，丙肝合剂对HCV基因表达的抑制作用显示，随着药物浓度的增加，HCV基因的转录水平下降，从而说明丙肝合剂能部分抑制HCV结构基因