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摘要：目的 观察六味地黄汤对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠环磷酸腺苷（cAMP）及脂肪组织磷酸二酯酶3B （PDE3B）的影响，探讨其改善2型糖尿病的作用机制。方法 将80只SD大鼠随机分为空白组和造模组，造模组采用高脂高糖喂养加腹腔注射STZ造模。将成模大鼠分为模型组、罗格列酮组、六味地黄汤组。各给药组每日给予相应药物灌胃，模型组和空白组给予等量生理盐水，连续30 d。常规检测大鼠空腹血糖（FBG），ELISA检测大鼠血清cAMP和胰岛素（INS）水平，Western Blot检测脂肪组织PDE3B蛋白表达，实时荧光定量PCR检测脂肪组织PDE3B mRNA表达。结果 与模型组比较，各给药组大鼠FBG、FINS水平降低（P<0.05，P<0.01）；六味地黄汤组大鼠脂肪组织PDE3B蛋白及mRNA表达升高、血清cAMP浓度降低（P<0.01）。结论 六味地黄汤可上调脂肪组织PDE3B因子表达，降低cAMP浓度，这可能是其改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用机制之一。
关键词：六味地黄汤；2型糖尿病；胰岛素抵抗；磷酸二酯酶3B；环磷酸腺苷；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.020
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）08-0073-04
Effects of Liuwei Dihuang Decoction on cAMP and PDE3B in Adipose Tissues of Rats with Type 2 Diabetes XIAO Zi-zeng1， ZENG Cheng-xi1， DAI Bing2， WU Qin-xuan1， CAO Lu-ting1， YANG Meng-lin1， ZHANG Jia-ni1 （1.Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；2.The First Affiliated Hospital to Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）
Abstract：Objective To observe the effects of Liuwei Dihuang Decoction on cAMP and PDE3B in adipose tissues of rats with type 2 diabetes；To explore its mechanism. Methods Totally 80 SD rats were randomly divided into two groups：control group and molding group. Rats in the molding group established the type 2 diabetic models by feeding high sugar and fat diet combined with intraperitoneal injection of Streptozotocin. The successful modeling rats were divided into model group， Rosiglitazone group， and Liuwei Dihuang Decoction group. Administration groups were given relevant medicine for gavage， while model group and blank group were given the same amount of normal saline for 30 days. FBG levels were detected， and cAMP and INS levels were detected by ELISA. The protein expressions of PDE3B in adipose tissues were determined by Western blot. The mRNA expressions of PDE3B in adipose tissues were detected by RT-PCR. Results Compared with the model group， the FBG and INS levels in type 2 diabetic rats were reduced in Rosiglitazone group and Liuwei Dihuang Decoction group （P<0.05， P<0.01）. In Liuwei Dihuang Decoction group， the protein and mRNA expressions of PDE3B in the adipose tissues were higher， and cAMP levels were lower than the model group （P<0.01）. Conclusion Liuwei Dihuang Decoction can increase PDE3B expression， and decrease cAMP level， which may be one of the mechanisms for improving insulin resistance in type 2 diabetic rats.
Key words：Liuwei Dihuang Decoction；type 2 diabetes；insulin resistance；PDE3B；cAMP；rats 基金项目：湖南省自然科学基金（13JJ3096）；湖南省科技计划一般项目（2010FJ4091）；湖南省高校创新平台开放基金项目（11K046）；康尔佳药业集团糖尿病研究所支持项目（2014年）
通讯作者：戴冰，E-mail：db0223@163.com
2型糖尿病是一种多基因遗传因素、环境因素综合作用引起的内分泌代谢性疾病，其发病机制主要包括β细胞功能障碍和胰岛素抵抗（IR）两方面，而IR为该病发生的中心环节。环核苷酸依赖的磷酸二酯酶3B （phosphodiesterase 3B，PDE3B）属于磷酸二酯酶（PDE）家族的亚型PDE3的成员之一[1]，通过对第二信使cAMP水解，在调节胰岛素抗糖原分解、抗脂解效应和分泌等生理过程中发挥重要作用。研究表明，导致IR发生的一些关键环节正是通过影响PDE3B的活性及表达而发挥作用[2]。六味地黄汤是改善2型糖尿病的经典方剂，可以改善糖尿病发病过程中的葡萄糖代谢异常，调节血脂[3]。本研究采用ELISA检测六味地黄汤对血清cAMP浓度的影响，采用Western blot和实时荧光定量PCR检测六味地黄汤对脂肪组织PDE3B蛋白及mRNA表达的影响，探讨其改善2型糖尿病的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级SD雄性大鼠80只，6周龄，体质量180～200 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（湘）2011-0003，合格证号4304700293，湖南中医药大学第一附属医院中心实验室饲养，分笼、无菌条件喂养，室温20～25 ℃，自由进食与饮水，每日12 h灯光照射。普通饲料由湖南中医药大学动物部提供，高糖高脂饲料（普通饲料70%，猪油10%，蔗糖15%，牛胆酸钠0.5%，胆固醇2.5%，食盐2%），湖南中医药大学动物部加工制作[4]。
1.2 药物
六味地黄汤（熟地黄24 g，山萸肉12 g，山药12 g，牡丹皮9 g，泽泻9 g，茯苓9 g）由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。称取六味地黄汤方原药材10剂，共750 g，先浸泡30 min，再煎2次，每次30 min，合并药液后水浴浓缩为质量浓度1.915 g/mL的六味地黄汤。罗格列酮钠片，太极集团重庆涪陵制药厂有限公司，批号10090198。
1.3 主要试剂
枸橼、磷酸氢二钠，台山市化工厂有限公司；链脲佐菌素（STZ），Sigma 公司；水合氯醛，天津市科密欧化学试剂有限公司；PDE3B antibody（sc-20793），美国Santa cruz公司；GAPDH antibody（60004-1-lg），美国Proteintech Group公司；ELISA检测试剂盒（CK-E30620R），R&D公司；荧光定量PCR试剂盒、组织蛋白裂解液、引物和内参GAPDH，长沙赛晶生物技术有限公司。
1.4 主要仪器
稳豪倍易型（ONETOUCH? UltraEasyTM）血糖仪及配套血糖试纸，强生（中国）医疗器材有限公司；MK3型酶标分析仪（美国）；荧光定量PCR仪（型号7900HT），美国ABI公司；核酸蛋白分析仪（型号BioPhotometer plus）、小型冷冻离心机（型号centrifuge 5415R），德国Eppendorf公司；稳压稳流电泳仪（型号DYY-2C），北京六一仪器厂；Bio-Rad凝胶成像分析系统（型号ChemiDocXRS），美国Bio-Rad公司。
2 实验方法
2.1 造模
80只SD雄性大鼠普通饲料适应性喂养1周，随机分为空白组（6只）和造模组（74只），分别给予普通饲料和高糖高脂饲料喂养4周后，所有动物禁食不禁水12 h，造模组大鼠腹腔注射1%STZ 45 mg/kg，空白组腹腔注射等体积枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液，注射STZ 72 h后断尾取血检测大鼠空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS），视FBG≥16.7 mmol/L[5]及胰岛素敏感指数（ISI）下降者为造模成功[6]。
2.2 分组、给药及取材
造模成功大鼠随机分为六味地黄汤组、罗格列酮组、模型组，每组14只。六味地黄汤组和罗格列酮组分别按临床等效剂量六味地黄汤6.75 g/（kg·d）、罗格列酮0.81 mg/（kg·d）灌胃，连续30 d。模型组、空白组予等体积蒸馏水，给药剂量按60 kg成人与200 g大鼠体表面积折算。大鼠禁食10 h，测FBG后腹腔注射10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉，解剖，腹主动脉取血，静置1 h后分离血清，-20 ℃冻存待检。取腹部脂肪组织，冻存于液氮中，置于-80 ℃冰箱中待用。
2.3 大鼠空腹血清胰岛素水平、血清环磷酸腺苷含量测定
严格按照ELISA试剂盒说明书操作，用紫外分光光度法测定OD值，利用标准曲线得到样本FINS、cAMP含量，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR=FINS×FBG÷22.5）、胰岛素敏感性指数[ISI=Ln1/（FBG×FINS）]。
2.4 大鼠脂肪组织磷酸二酯酶3B蛋白表达水平测定
用含有蛋白酶抑制剂的组织裂解液RIPA冰上将脂肪及肝组织经匀浆和超声粉碎后，静置30 min， 4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清。采用考马斯亮蓝法测总蛋白含量。取各组样品50 μg总蛋白上样于4%浓缩胶和8%分离胶中SDS-PAGE电泳，使样品中蛋白质分离，用湿转法转移至PVDF膜上，将转印膜置于装有封闭液（5%脱脂奶粉溶液）的孵育盒中，4 ℃过夜。加入一抗（PDE3B一抗稀释度为1∶1000，GAPDH一抗稀释度为1∶5000），室温孵育4 h，TBST冲洗3次，10 min/次，加入二抗（稀释度均为1∶2000），孵育2 h，TTBS冲洗3次。超敏发光液A液和B液等量混合点于转印膜上，ECL发光显色。用Bio-Rad凝胶自动成像系统对图中印迹区带进行相对定量分析。 2.5 大鼠脂肪组织磷酸二酯酶3B mRNA表达测定
每组取6只大鼠的脂肪标本进行mRNA检测，采用Trizol法抽提大鼠脂肪总RNA，RT-PCR反应依据Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明进行。PCR反应扩增PDE3B所用引物见表1。20 μL反转录体系中加入RNA 1 μg。核酸蛋白分析仪测定RNA量和纯度。其中磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照。PCR反应采用SYBR? Premix Ex Taq?（Takara）试剂，在ABI 7900HT荧光定量PCR仪上进行PCR反应。使用Sequence Detection software 1.2.3软件（Applied Biosystems公司）分析PCR过程各检测样本的Ct值，相对表达量用2?ΔΔCt进行计算。
191
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。所有数据以—x±s表示，采用正态性检验及方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 六味地黄汤对大鼠血糖、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数和胰岛素敏感性指数的影响
与空白组比较，模型组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR明显升高（P<0.01），ISI明显降低（P<0.01）；与模型组比较，六味地黄汤组、罗格列酮组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR明显降低（P<0.05，P<0.01），ISI值明显升高（P<0.01）。结果见表2。
4.2 六味地黄汤对大鼠血清环磷酸腺苷含量的影响
与空白组比较，模型组大鼠cAMP含量明显升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清cAMP含量明显降低（P<0.05）。结果见表3。
4.3 六味地黄汤对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠脂肪组织磷酸二酯酶3B蛋白表达的影响
与空白组比较，模型组PDE3B蛋白表达量明显降低（P<0.01）；与模型组比较，两给药组PDE3B蛋白表达量明显升高（P<0.01）。结果见表4、图1。
4.4 六味地黄汤对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠脂肪组织磷酸二酯酶3B mRNA表达的影响
与空白组比较，模型组大鼠PDE3B mRNA相对表达明显降低（P<0.01）；与模型组比较，给药组PDE3B基因相对表达量明显升高（P<0.01）。结果见表5。大鼠PDE3B mRNA扩增曲线和融解曲线见图2。
5 讨论
糖尿病属中医“消渴”范畴，乃素体阴虚、饮食不节等因素导致机体阴燥热、气阴两伤、阴阳俱虚等病证，并以阴虚为本。六味地黄丸出自宋代钱乙所著《小儿药证直诀》，是治疗肾阴虚证的经典方剂。目前在糖尿病的临床治疗上广泛应用。实验研究表明，其在改善糖和脂质代谢、改善IR方面具有一定作用[5]。研究发现，六味地黄汤能降低2型糖尿病大鼠FBG及胆固醇、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇含量，升高高密度脂蛋白胆固醇含量，推测六味地黄汤干预2型糖尿病作用可能与其改善脂代谢有关[6]。
在胰岛素信号传导通路PI3K/Akt通路中，PI3K活化后可致细胞脂质磷酸化而激活Akt，从而促进葡萄糖转运、脂肪及糖原合成，其功能缺陷可以导致IR[7]。PDE3B是其Akt的重要的生理底物之一，主要分布在细胞膜上，胰岛素应答时，Akt会从胞内转运至质膜，以激活PDE3B。PDE3B被激活后，随即水解cAMP， cAMP又通过依赖蛋白激酶A（PKA）和不依赖PKA两条通路发挥作用，最终参与对葡萄糖转运和脂肪代谢的调控[8]。因此，PDE3B活性下降会导致胰岛素诱导的PI3K/Akt通路受阻，这使脂肪对胰岛素敏感性减弱，从而诱发IR，最终可能导致2型糖尿病的发生。
本研究发现，六味地黄汤可增强2型糖尿病IR大鼠胰岛素敏感性，明显促进脂肪组织PDE3B的蛋白及mRNA表达，降低血清cAMP浓度。这与Nagaoka T等[9]研究的在糖尿病个体的脂肪组织中PDE3B表达下降，给予抗糖尿病药物后可恢复正常的结论具有一致性。由此，我们推测六味地黄汤改善2型糖尿病IR大鼠的作用机制之一可能是通过上调脂肪组织中PDE3B因子的表达，从而促进其被Akt磷酸化和激活，降低细胞内环磷酸腺苷cAMP水平，使PKA活性下降，最终导致贮存的TG水解减少及游离脂肪酸从脂肪细胞中释放减少，从而减轻IR。胰岛素PI3K/Akt信号传导通路中的各个因子相互联系相互影响构成一个复杂的网络，任何一个环节发生障碍都可能导致IR。六味地黄汤可上调脂肪组织PDE3B因子表达，降低cAMP浓度，达到治疗2型糖尿病的目的。
参考文献：
[1] Miki T， Taira M， Hockman S， et al. Characterization of the cDNA and gene encoding human PDE3B， the cGIP1 isoform of the human cyclic GMP-inhibited cyclic nucleotide phosphodiesterase family[J]. Genomics，1996，36：476-485.
[2] 洪兵，刘红.PDE3B与胰岛素抵抗[J].国外医学：内分泌学分册，2003， 23（增刊）：29-31.
[3] 谢奇.六味地黄丸在2型糖尿病治疗中的作用与研究[J].中医临床研究，2013，5（1）：116-118.
[4] 王保伟，李颖，刘晓红.高脂饲料喂养时间及链脲佐菌素剂量对实验型2型糖尿病大鼠造模的影响[J].卫生研究，2011，40（1）：99-106.
[5] 赵晓琴，赵俊杰，张燕，等.链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠的心肌损伤观察及机制初探[J].中国心血管病研究，2010，8（1）：52-56.
[6] 薄海美，田春雨，李继春.银耳多糖对实验性2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响[J].时珍国医国药，2011，22（8）：1926-1927.
[7] 张新杰，刘建坤，高冬梅，等.吡咯烷二硫代氨基甲酸酯对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用[J].中国病理生理杂志，2011，28（10）：1807-1811.
[8] 赵宇昊，刘蕴，齐舫.六味地黄丸治疗2型糖尿病的研究近况[J].北京中医，2005，24（4）：245-246.
[9] Nagaoka T， Shirakawa T， Balon TW， et al. Cyclic nucleotide phosphodiesterase 3 expression in vivo：evidence for tissue- specific expression of phosphodiesterase 3A or 3B mRNA and activity in the aorta and adipose tissue of atherosclerosis-prone insulin-resistant rats[J]. Diabetes，1998，47：1135-1144.
（收稿日期：2015-01-16；编辑：华强）
关键词：六味地黄汤；2型糖尿病；胰岛素抵抗；磷酸二酯酶3B；环磷酸腺苷；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.020
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）08-0073-04
Effects of Liuwei Dihuang Decoction on cAMP and PDE3B in Adipose Tissues of Rats with Type 2 Diabetes XIAO Zi-zeng1， ZENG Cheng-xi1， DAI Bing2， WU Qin-xuan1， CAO Lu-ting1， YANG Meng-lin1， ZHANG Jia-ni1 （1.Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；2.The First Affiliated Hospital to Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）
Abstract：Objective To observe the effects of Liuwei Dihuang Decoction on cAMP and PDE3B in adipose tissues of rats with type 2 diabetes；To explore its mechanism. Methods Totally 80 SD rats were randomly divided into two groups：control group and molding group. Rats in the molding group established the type 2 diabetic models by feeding high sugar and fat diet combined with intraperitoneal injection of Streptozotocin. The successful modeling rats were divided into model group， Rosiglitazone group， and Liuwei Dihuang Decoction group. Administration groups were given relevant medicine for gavage， while model group and blank group were given the same amount of normal saline for 30 days. FBG levels were detected， and cAMP and INS levels were detected by ELISA. The protein expressions of PDE3B in adipose tissues were determined by Western blot. The mRNA expressions of PDE3B in adipose tissues were detected by RT-PCR. Results Compared with the model group， the FBG and INS levels in type 2 diabetic rats were reduced in Rosiglitazone group and Liuwei Dihuang Decoction group （P<0.05， P<0.01）. In Liuwei Dihuang Decoction group， the protein and mRNA expressions of PDE3B in the adipose tissues were higher， and cAMP levels were lower than the model group （P<0.01）. Conclusion Liuwei Dihuang Decoction can increase PDE3B expression， and decrease cAMP level， which may be one of the mechanisms for improving insulin resistance in type 2 diabetic rats.
Key words：Liuwei Dihuang Decoction；type 2 diabetes；insulin resistance；PDE3B；cAMP；rats 基金项目：湖南省自然科学基金（13JJ3096）；湖南省科技计划一般项目（2010FJ4091）；湖南省高校创新平台开放基金项目（11K046）；康尔佳药业集团糖尿病研究所支持项目（2014年）
通讯作者：戴冰，E-mail：db0223@163.com
2型糖尿病是一种多基因遗传因素、环境因素综合作用引起的内分泌代谢性疾病，其发病机制主要包括β细胞功能障碍和胰岛素抵抗（IR）两方面，而IR为该病发生的中心环节。环核苷酸依赖的磷酸二酯酶3B （phosphodiesterase 3B，PDE3B）属于磷酸二酯酶（PDE）家族的亚型PDE3的成员之一[1]，通过对第二信使cAMP水解，在调节胰岛素抗糖原分解、抗脂解效应和分泌等生理过程中发挥重要作用。研究表明，导致IR发生的一些关键环节正是通过影响PDE3B的活性及表达而发挥作用[2]。六味地黄汤是改善2型糖尿病的经典方剂，可以改善糖尿病发病过程中的葡萄糖代谢异常，调节血脂[3]。本研究采用ELISA检测六味地黄汤对血清cAMP浓度的影响，采用Western blot和实时荧光定量PCR检测六味地黄汤对脂肪组织PDE3B蛋白及mRNA表达的影响，探讨其改善2型糖尿病的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级SD雄性大鼠80只，6周龄，体质量180～200 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（湘）2011-0003，合格证号4304700293，湖南中医药大学第一附属医院中心实验室饲养，分笼、无菌条件喂养，室温20～25 ℃，自由进食与饮水，每日12 h灯光照射。普通饲料由湖南中医药大学动物部提供，高糖高脂饲料（普通饲料70%，猪油10%，蔗糖15%，牛胆酸钠0.5%，胆固醇2.5%，食盐2%），湖南中医药大学动物部加工制作[4]。
1.2 药物
六味地黄汤（熟地黄24 g，山萸肉12 g，山药12 g，牡丹皮9 g，泽泻9 g，茯苓9 g）由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。称取六味地黄汤方原药材10剂，共750 g，先浸泡30 min，再煎2次，每次30 min，合并药液后水浴浓缩为质量浓度1.915 g/mL的六味地黄汤。罗格列酮钠片，太极集团重庆涪陵制药厂有限公司，批号10090198。
1.3 主要试剂
枸橼、磷酸氢二钠，台山市化工厂有限公司；链脲佐菌素（STZ），Sigma 公司；水合氯醛，天津市科密欧化学试剂有限公司；PDE3B antibody（sc-20793），美国Santa cruz公司；GAPDH antibody（60004-1-lg），美国Proteintech Group公司；ELISA检测试剂盒（CK-E30620R），R&D公司；荧光定量PCR试剂盒、组织蛋白裂解液、引物和内参GAPDH，长沙赛晶生物技术有限公司。
1.4 主要仪器
稳豪倍易型（ONETOUCH? UltraEasyTM）血糖仪及配套血糖试纸，强生（中国）医疗器材有限公司；MK3型酶标分析仪（美国）；荧光定量PCR仪（型号7900HT），美国ABI公司；核酸蛋白分析仪（型号BioPhotometer plus）、小型冷冻离心机（型号centrifuge 5415R），德国Eppendorf公司；稳压稳流电泳仪（型号DYY-2C），北京六一仪器厂；Bio-Rad凝胶成像分析系统（型号ChemiDocXRS），美国Bio-Rad公司。
2 实验方法
2.1 造模
80只SD雄性大鼠普通饲料适应性喂养1周，随机分为空白组（6只）和造模组（74只），分别给予普通饲料和高糖高脂饲料喂养4周后，所有动物禁食不禁水12 h，造模组大鼠腹腔注射1%STZ 45 mg/kg，空白组腹腔注射等体积枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液，注射STZ 72 h后断尾取血检测大鼠空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS），视FBG≥16.7 mmol/L[5]及胰岛素敏感指数（ISI）下降者为造模成功[6]。
2.2 分组、给药及取材
造模成功大鼠随机分为六味地黄汤组、罗格列酮组、模型组，每组14只。六味地黄汤组和罗格列酮组分别按临床等效剂量六味地黄汤6.75 g/（kg·d）、罗格列酮0.81 mg/（kg·d）灌胃，连续30 d。模型组、空白组予等体积蒸馏水，给药剂量按60 kg成人与200 g大鼠体表面积折算。大鼠禁食10 h，测FBG后腹腔注射10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉，解剖，腹主动脉取血，静置1 h后分离血清，-20 ℃冻存待检。取腹部脂肪组织，冻存于液氮中，置于-80 ℃冰箱中待用。
2.3 大鼠空腹血清胰岛素水平、血清环磷酸腺苷含量测定
严格按照ELISA试剂盒说明书操作，用紫外分光光度法测定OD值，利用标准曲线得到样本FINS、cAMP含量，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR=FINS×FBG÷22.5）、胰岛素敏感性指数[ISI=Ln1/（FBG×FINS）]。
2.4 大鼠脂肪组织磷酸二酯酶3B蛋白表达水平测定
用含有蛋白酶抑制剂的组织裂解液RIPA冰上将脂肪及肝组织经匀浆和超声粉碎后，静置30 min， 4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清。采用考马斯亮蓝法测总蛋白含量。取各组样品50 μg总蛋白上样于4%浓缩胶和8%分离胶中SDS-PAGE电泳，使样品中蛋白质分离，用湿转法转移至PVDF膜上，将转印膜置于装有封闭液（5%脱脂奶粉溶液）的孵育盒中，4 ℃过夜。加入一抗（PDE3B一抗稀释度为1∶1000，GAPDH一抗稀释度为1∶5000），室温孵育4 h，TBST冲洗3次，10 min/次，加入二抗（稀释度均为1∶2000），孵育2 h，TTBS冲洗3次。超敏发光液A液和B液等量混合点于转印膜上，ECL发光显色。用Bio-Rad凝胶自动成像系统对图中印迹区带进行相对定量分析。 2.5 大鼠脂肪组织磷酸二酯酶3B mRNA表达测定
每组取6只大鼠的脂肪标本进行mRNA检测，采用Trizol法抽提大鼠脂肪总RNA，RT-PCR反应依据Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明进行。PCR反应扩增PDE3B所用引物见表1。20 μL反转录体系中加入RNA 1 μg。核酸蛋白分析仪测定RNA量和纯度。其中磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照。PCR反应采用SYBR? Premix Ex Taq?（Takara）试剂，在ABI 7900HT荧光定量PCR仪上进行PCR反应。使用Sequence Detection software 1.2.3软件（Applied Biosystems公司）分析PCR过程各检测样本的Ct值，相对表达量用2?ΔΔCt进行计算。
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3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。所有数据以—x±s表示，采用正态性检验及方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 六味地黄汤对大鼠血糖、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数和胰岛素敏感性指数的影响
与空白组比较，模型组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR明显升高（P<0.01），ISI明显降低（P<0.01）；与模型组比较，六味地黄汤组、罗格列酮组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR明显降低（P<0.05，P<0.01），ISI值明显升高（P<0.01）。结果见表2。
4.2 六味地黄汤对大鼠血清环磷酸腺苷含量的影响
与空白组比较，模型组大鼠cAMP含量明显升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清cAMP含量明显降低（P<0.05）。结果见表3。
4.3 六味地黄汤对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠脂肪组织磷酸二酯酶3B蛋白表达的影响
与空白组比较，模型组PDE3B蛋白表达量明显降低（P<0.01）；与模型组比较，两给药组PDE3B蛋白表达量明显升高（P<0.01）。结果见表4、图1。
4.4 六味地黄汤对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠脂肪组织磷酸二酯酶3B mRNA表达的影响
与空白组比较，模型组大鼠PDE3B mRNA相对表达明显降低（P<0.01）；与模型组比较，给药组PDE3B基因相对表达量明显升高（P<0.01）。结果见表5。大鼠PDE3B mRNA扩增曲线和融解曲线见图2。
5 讨论
糖尿病属中医“消渴”范畴，乃素体阴虚、饮食不节等因素导致机体阴燥热、气阴两伤、阴阳俱虚等病证，并以阴虚为本。六味地黄丸出自宋代钱乙所著《小儿药证直诀》，是治疗肾阴虚证的经典方剂。目前在糖尿病的临床治疗上广泛应用。实验研究表明，其在改善糖和脂质代谢、改善IR方面具有一定作用[5]。研究发现，六味地黄汤能降低2型糖尿病大鼠FBG及胆固醇、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇含量，升高高密度脂蛋白胆固醇含量，推测六味地黄汤干预2型糖尿病作用可能与其改善脂代谢有关[6]。
在胰岛素信号传导通路PI3K/Akt通路中，PI3K活化后可致细胞脂质磷酸化而激活Akt，从而促进葡萄糖转运、脂肪及糖原合成，其功能缺陷可以导致IR[7]。PDE3B是其Akt的重要的生理底物之一，主要分布在细胞膜上，胰岛素应答时，Akt会从胞内转运至质膜，以激活PDE3B。PDE3B被激活后，随即水解cAMP， cAMP又通过依赖蛋白激酶A（PKA）和不依赖PKA两条通路发挥作用，最终参与对葡萄糖转运和脂肪代谢的调控[8]。因此，PDE3B活性下降会导致胰岛素诱导的PI3K/Akt通路受阻，这使脂肪对胰岛素敏感性减弱，从而诱发IR，最终可能导致2型糖尿病的发生。
本研究发现，六味地黄汤可增强2型糖尿病IR大鼠胰岛素敏感性，明显促进脂肪组织PDE3B的蛋白及mRNA表达，降低血清cAMP浓度。这与Nagaoka T等[9]研究的在糖尿病个体的脂肪组织中PDE3B表达下降，给予抗糖尿病药物后可恢复正常的结论具有一致性。由此，我们推测六味地黄汤改善2型糖尿病IR大鼠的作用机制之一可能是通过上调脂肪组织中PDE3B因子的表达，从而促进其被Akt磷酸化和激活，降低细胞内环磷酸腺苷cAMP水平，使PKA活性下降，最终导致贮存的TG水解减少及游离脂肪酸从脂肪细胞中释放减少，从而减轻IR。胰岛素PI3K/Akt信号传导通路中的各个因子相互联系相互影响构成一个复杂的网络，任何一个环节发生障碍都可能导致IR。六味地黄汤可上调脂肪组织PDE3B因子表达，降低cAMP浓度，达到治疗2型糖尿病的目的。
参考文献：
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（收稿日期：2015-01-16；编辑：华强）