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摘要：目的 建立護肠清毒微丸灌胃后大鼠血浆和结肠组织中大黄素浓度高效液相色谱测定方法，探讨试验微丸在大鼠体内药物动力学性质及结肠组织分布情况。方法 将Wistar大鼠随机分为微丸组和普通胶囊组，分别予护肠清毒微丸和胶囊内容物灌胃后，于给定的时间点（1、2、3、4、5、6、8、12、24 h）从大鼠静脉窦取血分析。处死大鼠，分离结肠组织，进行提取分析。色谱条件：Phenomenex C18柱（4.6 mm×150 mm，10 ?m），流动相为甲醇-0.1%冰醋酸溶液（80∶20），流速1 mL/min，检测波长254 nm。结果 大黄素在0.102～20.40 ?g/mL范围内线性关系良好。回归方程分别为：血浆溶液A=76 825C+3567.8，r=0.999 4（n=6）；结肠组织溶液A=75931C+3384.2，r=0.999 0（n=6）。日间精密度和日内精密度均<4.0%，提取回收率>90.0%。微丸组大鼠血液和结肠组织中所含大黄素的药物动力学参数T1/2和Tmax较普通胶囊组有所延长，Cmax和AUC0-24较普通胶囊组明显提高。结论 护肠清毒微丸具有控释和结肠靶向的作用。
关键词：护肠清毒微丸；大黄素；结肠靶向；药物动力学
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.022
中图分类号：R285 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）09-0079-04
Pharmacokinetic and Intestinal Absorption Study on Rats of Emodin in Colon-Targeted Huchang Qingdu Pellets SUN Ping1， MA Chuan-jiang1， LIU Le-yang2 （1.Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250011， China；2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250000， China）
Abstract：Objective To establish an HPLC method for concentration determination of emodin in plasma and colon tissues after gavage with Huchang Qingdu Pellets；To explore pharmacokinetic properties and colon tissue distribution of Huchang Qingdu Pellets in rats. Methods Wistar rats were randomly divided into Pellets group and ordinary capsule group. Blood was taken after gavage with Huchang Qingdu Pellets or capsule content in given time points （1， 2， 3， 4， 5， 6， 8， 12， 24 h） from rat venous sinus and analyzed. Rats were put to death， and gastric and colon tissues were isolated and extracted for analysis. Chromatographic conditions：Phenomenex C18 column （4.6 mm × 150 mm， 10 μm）， the mobile phase of methanol-0.1% acetic acid solution （80∶20）， flow rate of 1 mL/min， the detection wavelength of 254 nm. Results Emodin was in good linear range of 0.102-20.40 μg/mL. The regression equations were：plasma solution A=76 825C + 3567.8， r=0.999 4 （n=6）；intestinal tissue solution A=75 931C + 3384.2， r=0.999 0 （n=6）. Day-to-day precision and within-day precision were less than 4%. The recovery rate was more than 90%. Pharmacokinetic parameters of T1/2 and Tmax of emodin in rat blood and intestinal tissues increased compared with the ordinary capsule group；Cmax and AUC0-24 were obviously improved compared with the ordinary capsule group. Conclusion Huchang Qingdu Pellets do have controlled release and colon targeting effect.
Key words：Huchang Qingdu Pellets；emodin；colon targeting；pharmacokinetics 结肠靶向护肠清毒微丸为山东中医药大学附属医院院内制剂，具有健脾清肠、化瘀解毒功效。处方由大黄、赤芍、紫草等10味中药组成，临床对肝病和肠源性内毒素血症的治疗有明显疗效[1-3]。结肠靶向护肠清毒微丸是对处方药物进行提取精制后，加入果胶钙制备微丸丸芯，经聚丙烯酸树脂包衣，制备成结肠定位靶向给药的控释微丸。
大黄为方中君药，具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经功效。大黄素为大黄的主要有效成分，有研究表明其对缺血再灌注损伤具有保护作用[4-5]。本试验选择大黄的主要有效成分大黄素为考察指标，比较结肠靶向护肠清毒微丸和普通胶囊内容物经大鼠口服后大黄素在血液及结肠组织中药物动力学性质，为进一步探讨护肠清毒微丸的作用机制和药效学评价提供试验依据。
1 仪器、试药与动物
ER-182A型电子天平（日本）；85B-2型磁力加热搅拌器（南通科学仪器厂）；SK1200B型超声清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；D800C智能药物溶出仪（天津大学无线电厂）；Biofuge Stratos全能台式高速冷冻离心机（德国Heraeus公司）；Waters600高效液相色谱仪（美国Waters公司），Waters 2996二极管阵列检测器（美国Waters公司），Microfluidizer（美国MicrofLudics公司）；80-2型离心沉淀机（江苏金坛市中大仪器厂）；JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所）。
大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号110736-200629），护肠清毒微丸（自制，批号分别为20100314、20100316、20100318），护肠清毒胶囊内容物（自制，批号20100320），甲醇为色谱纯，其他试剂均为市售分析纯。
Wistar大鼠92只，雌雄各半，50日龄，体质量（200±20）g，山东大学实验动物中心，动物合格证号SCXK（鲁）20100004号。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
采用Phenomenex C18色谱柱（4.6 mm×150 mm， 10 ?m），流动相为甲醇-0.1%冰醋酸溶液（80∶20），流速1 mL/min，检测波长254 nm，柱温为室温[6]。理论塔板数按大黄素峰计算不低于2500。
在此色谱条件下，大鼠血浆和结肠组织的微丸和普通胶囊样品中大黄素均可检出，且血浆和组织液中的内源性物质不干扰大黄素的测定。色谱图见图1、图2。
2.2 给药方案与血样、结肠组织的采集
将90只Wistar大鼠随机分为微丸组和普通胶囊组各45只，大鼠禁食12 h，用乙醚轻度麻醉后，经口插入聚乙烯管。微丸组通过聚乙烯管给大鼠口服护肠清毒微丸0.2 g，再灌入1 mL蒸馏水；普通胶囊组口服自制护肠清毒胶囊的内容物0.05 g（与微丸的含药粉量相当），再灌入1 mL蒸馏水。于给定的时间点（1、2、3、4、5、6、8、12、24 h）用负压针从大鼠静脉窦取血0.5 mL，每个时间点取5只大鼠，血样置肝素化试管中，3500 r/min离心10 min，分离血浆，分别标记，于-20 ℃以下保存待测[7]。取血后脊椎脱臼法处死大鼠，分离结肠组织，用生理盐水冲洗干净，称重，将结肠组织分别切成小块，封装、标记，于-20 ℃以下保存待测。
2.3 供试品溶液的制备
2.3.1 血漿样品的制备 准确吸取大鼠血浆0.5 mL，置5 mL锥形试管中，加甲醇1.5 mL，涡旋混合3 min， 3000 r/min离心5 min，吸取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，进样20 μL。
2.3.2 结肠组织液样品的制备 取称重后的结肠小块，加入1 mL生理盐水，20 000 r/min匀浆2 min，至组织全部分散，6000 r/min离心15 min，取上清液，加入3 mL甲醇，涡旋混合3 min，6000 r/min离心15 min，吸取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，进样20 μL。
2.4 对照品溶液的制备
精密称取大黄素对照品2.55 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并释至刻度，摇匀，得对照品储备液。
2.5 大鼠血浆及结肠组织标准曲线的建立
取对照品储备液适量，分别加入空白血浆和结肠组织，配制成大黄素0.010 2 mg/mL的血浆储备液和肠组织储备液各25 mL。精密量取2种储备液适量，分别配制成浓度为0.102、0.510、1.020、5.100、10.20、20.40 μg/mL的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样，测定峰面积（A），以进样浓度（C）为横坐标，A为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。血浆溶液：A=76 825C+3567.8，r=0.999 4（n=6）；肠组织溶液：A=75 931C+3384.2，r=0.999 0（n=6）。大黄素在0.102～20.40 μg/mL范围内线性关系良好。方法检出限为0.002 μg/mL。
2.6 精密度试验
分别用大鼠空白血浆和结肠组织配制低、中、高3种浓度（0.102、1.020、10.20 μg/mL）的含大黄素对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，1 d内测定5次以计算日内精密度，每日测定1次连续5 d以计算日间精密度。结果3种浓度溶液的日内精密度：加空白血浆的RSD分别为2.51%、1.40%、0.99%，加结肠组织的RSD分别为1.92%、1.19%、0.50%。日间精密度：加空白血浆的RSD分别为3.39%、3.14%、2.59%，加结肠组织的RSD分别为3.42%、3.17%、2.66%。表明精密度良好，可满足生物样品分析方法要求。
2.7 稳定性试验 取供试品溶液，每隔2 h进样1次，连续测定7次，计算RSD=2.91%，表明样品在12 h内稳定。
2.8 重复性试验
精密称取样品5份，按“2.3”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件测其峰面积，RSD=1.4%，表明重复性良好。
2.9 加样回收率试验
精密量取2 mL空白血浆、结肠组织上清液，精密加入不同浓度的大黄素对照品适量，按“2.4”项下方法制成高、中、低3种浓度的样品，进行测定，分别记录峰面积，每个浓度平行测定3次，按标准曲线计算血浆药物浓度C1。以生理盐水代替血浆和结肠组织上清液，同法操作，按标准曲线计算血浆药物浓度C2，以C2/C1计算回收率，结果见表1。可以看出，血浆和结肠组织加样回收率均>90%，RSD<5%，可满足生物样品分析方法要求。
2.10 藥物动力学研究和大黄素结肠组织分布研究
根据测定的结果，采用3P87药代动力学计算程序对血药浓度时间数据进行拟合分析，算出大鼠给药后大黄素的药物动力学参数，结果见表2、表3，平均药时曲线见图3、图4。结果表明，经结肠靶向微丸给药后，大鼠血液和肠组织中所含大黄素的药物动力学参数T1/2、和Tmax较普通胶囊组有所延长，说明微丸进入大鼠体内分布和消除均较慢，具有一定的缓释作用；Cmax和AUC0-24较普通胶囊组明显提高，说明结肠靶向微丸通过结肠定位释放，可明显提高药物在结肠组织中大黄素的含量，从而有效提高药物的生物利用度。
3 讨论
口服结肠定位给药系统是通过口服达到结肠定位释放的目的，避免药物在胃的吸收，提高药物在结肠部位的局部浓度，充分发挥药物的治疗作用，降低药物的不良反应，提高易被胃酸破坏或被胰酶代谢药物（如蛋白质、多肽类大分子药物）的生物利用度[8]。
本试验通过考察大鼠给药后不同时间血液和结肠组织中大黄素的含量变化，说明药物在制备成结肠靶向微丸后，其主要有效成分大黄素的吸收明显滞后，在胃中稳定，几乎没有药物释放，而在结肠处大量释放药物，体现了口服结肠定位给药的典型特征。微丸组和普通胶囊组的药时曲线下降近似平行，说明两制剂在体内吸收后的变化基本相同，结肠靶向微丸主要在结肠部位释放，普通胶囊主要在胃中释放，达到了口服结肠定位的给药目的。
参考文献：
[1] Li Yong， Wang Lei， Su Chao， et al. Clinical observation on the treatment of chronic severe hepatitis B by retention enema with Huchang Jiedu Decoction[J]. Chin J Integr Med，2010，16（4）：348-352.
[2] 王磊，李勇，孙欢娜.肝病实脾验案[J].山东中医杂志，2012，31（1）：64-66.
[3] 李勇.病毒性肝炎的中医思维理念与思考[J].世界中医药，2008，3（1）：8-9.
[4] 熊兴富.中药大黄主要有效成分药理学研究进展[J].中医临床研究， 2014，6（10）：143-146.
[5] 冯俊光，吴先平，韦志军，等.大黄素对小鼠肠缺血/再灌注肺损伤的保护作用[J].新中医，2011，43（6）：130-131.
[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：22.
[7] 叶少梅，欧卫平.大鼠心脏取血法[J].上海实验动物科学，1999，19（3）：177.
[8] 郎美琦，黄佳盛.口服结肠定位给药系统的研究进展[J].中国药物与临床，2010，10（4）：441-443.
（收稿日期：2015-01-07；编辑：陈静）
关键词：护肠清毒微丸；大黄素；结肠靶向；药物动力学
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.022
中图分类号：R285 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）09-0079-04
Pharmacokinetic and Intestinal Absorption Study on Rats of Emodin in Colon-Targeted Huchang Qingdu Pellets SUN Ping1， MA Chuan-jiang1， LIU Le-yang2 （1.Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250011， China；2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250000， China）
Abstract：Objective To establish an HPLC method for concentration determination of emodin in plasma and colon tissues after gavage with Huchang Qingdu Pellets；To explore pharmacokinetic properties and colon tissue distribution of Huchang Qingdu Pellets in rats. Methods Wistar rats were randomly divided into Pellets group and ordinary capsule group. Blood was taken after gavage with Huchang Qingdu Pellets or capsule content in given time points （1， 2， 3， 4， 5， 6， 8， 12， 24 h） from rat venous sinus and analyzed. Rats were put to death， and gastric and colon tissues were isolated and extracted for analysis. Chromatographic conditions：Phenomenex C18 column （4.6 mm × 150 mm， 10 μm）， the mobile phase of methanol-0.1% acetic acid solution （80∶20）， flow rate of 1 mL/min， the detection wavelength of 254 nm. Results Emodin was in good linear range of 0.102-20.40 μg/mL. The regression equations were：plasma solution A=76 825C + 3567.8， r=0.999 4 （n=6）；intestinal tissue solution A=75 931C + 3384.2， r=0.999 0 （n=6）. Day-to-day precision and within-day precision were less than 4%. The recovery rate was more than 90%. Pharmacokinetic parameters of T1/2 and Tmax of emodin in rat blood and intestinal tissues increased compared with the ordinary capsule group；Cmax and AUC0-24 were obviously improved compared with the ordinary capsule group. Conclusion Huchang Qingdu Pellets do have controlled release and colon targeting effect.
Key words：Huchang Qingdu Pellets；emodin；colon targeting；pharmacokinetics 结肠靶向护肠清毒微丸为山东中医药大学附属医院院内制剂，具有健脾清肠、化瘀解毒功效。处方由大黄、赤芍、紫草等10味中药组成，临床对肝病和肠源性内毒素血症的治疗有明显疗效[1-3]。结肠靶向护肠清毒微丸是对处方药物进行提取精制后，加入果胶钙制备微丸丸芯，经聚丙烯酸树脂包衣，制备成结肠定位靶向给药的控释微丸。
大黄为方中君药，具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经功效。大黄素为大黄的主要有效成分，有研究表明其对缺血再灌注损伤具有保护作用[4-5]。本试验选择大黄的主要有效成分大黄素为考察指标，比较结肠靶向护肠清毒微丸和普通胶囊内容物经大鼠口服后大黄素在血液及结肠组织中药物动力学性质，为进一步探讨护肠清毒微丸的作用机制和药效学评价提供试验依据。
1 仪器、试药与动物
ER-182A型电子天平（日本）；85B-2型磁力加热搅拌器（南通科学仪器厂）；SK1200B型超声清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；D800C智能药物溶出仪（天津大学无线电厂）；Biofuge Stratos全能台式高速冷冻离心机（德国Heraeus公司）；Waters600高效液相色谱仪（美国Waters公司），Waters 2996二极管阵列检测器（美国Waters公司），Microfluidizer（美国MicrofLudics公司）；80-2型离心沉淀机（江苏金坛市中大仪器厂）；JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所）。
大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号110736-200629），护肠清毒微丸（自制，批号分别为20100314、20100316、20100318），护肠清毒胶囊内容物（自制，批号20100320），甲醇为色谱纯，其他试剂均为市售分析纯。
Wistar大鼠92只，雌雄各半，50日龄，体质量（200±20）g，山东大学实验动物中心，动物合格证号SCXK（鲁）20100004号。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
采用Phenomenex C18色谱柱（4.6 mm×150 mm， 10 ?m），流动相为甲醇-0.1%冰醋酸溶液（80∶20），流速1 mL/min，检测波长254 nm，柱温为室温[6]。理论塔板数按大黄素峰计算不低于2500。
在此色谱条件下，大鼠血浆和结肠组织的微丸和普通胶囊样品中大黄素均可检出，且血浆和组织液中的内源性物质不干扰大黄素的测定。色谱图见图1、图2。
2.2 给药方案与血样、结肠组织的采集
将90只Wistar大鼠随机分为微丸组和普通胶囊组各45只，大鼠禁食12 h，用乙醚轻度麻醉后，经口插入聚乙烯管。微丸组通过聚乙烯管给大鼠口服护肠清毒微丸0.2 g，再灌入1 mL蒸馏水；普通胶囊组口服自制护肠清毒胶囊的内容物0.05 g（与微丸的含药粉量相当），再灌入1 mL蒸馏水。于给定的时间点（1、2、3、4、5、6、8、12、24 h）用负压针从大鼠静脉窦取血0.5 mL，每个时间点取5只大鼠，血样置肝素化试管中，3500 r/min离心10 min，分离血浆，分别标记，于-20 ℃以下保存待测[7]。取血后脊椎脱臼法处死大鼠，分离结肠组织，用生理盐水冲洗干净，称重，将结肠组织分别切成小块，封装、标记，于-20 ℃以下保存待测。
2.3 供试品溶液的制备
2.3.1 血漿样品的制备 准确吸取大鼠血浆0.5 mL，置5 mL锥形试管中，加甲醇1.5 mL，涡旋混合3 min， 3000 r/min离心5 min，吸取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，进样20 μL。
2.3.2 结肠组织液样品的制备 取称重后的结肠小块，加入1 mL生理盐水，20 000 r/min匀浆2 min，至组织全部分散，6000 r/min离心15 min，取上清液，加入3 mL甲醇，涡旋混合3 min，6000 r/min离心15 min，吸取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，进样20 μL。
2.4 对照品溶液的制备
精密称取大黄素对照品2.55 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并释至刻度，摇匀，得对照品储备液。
2.5 大鼠血浆及结肠组织标准曲线的建立
取对照品储备液适量，分别加入空白血浆和结肠组织，配制成大黄素0.010 2 mg/mL的血浆储备液和肠组织储备液各25 mL。精密量取2种储备液适量，分别配制成浓度为0.102、0.510、1.020、5.100、10.20、20.40 μg/mL的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样，测定峰面积（A），以进样浓度（C）为横坐标，A为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。血浆溶液：A=76 825C+3567.8，r=0.999 4（n=6）；肠组织溶液：A=75 931C+3384.2，r=0.999 0（n=6）。大黄素在0.102～20.40 μg/mL范围内线性关系良好。方法检出限为0.002 μg/mL。
2.6 精密度试验
分别用大鼠空白血浆和结肠组织配制低、中、高3种浓度（0.102、1.020、10.20 μg/mL）的含大黄素对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，1 d内测定5次以计算日内精密度，每日测定1次连续5 d以计算日间精密度。结果3种浓度溶液的日内精密度：加空白血浆的RSD分别为2.51%、1.40%、0.99%，加结肠组织的RSD分别为1.92%、1.19%、0.50%。日间精密度：加空白血浆的RSD分别为3.39%、3.14%、2.59%，加结肠组织的RSD分别为3.42%、3.17%、2.66%。表明精密度良好，可满足生物样品分析方法要求。
2.7 稳定性试验 取供试品溶液，每隔2 h进样1次，连续测定7次，计算RSD=2.91%，表明样品在12 h内稳定。
2.8 重复性试验
精密称取样品5份，按“2.3”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件测其峰面积，RSD=1.4%，表明重复性良好。
2.9 加样回收率试验
精密量取2 mL空白血浆、结肠组织上清液，精密加入不同浓度的大黄素对照品适量，按“2.4”项下方法制成高、中、低3种浓度的样品，进行测定，分别记录峰面积，每个浓度平行测定3次，按标准曲线计算血浆药物浓度C1。以生理盐水代替血浆和结肠组织上清液，同法操作，按标准曲线计算血浆药物浓度C2，以C2/C1计算回收率，结果见表1。可以看出，血浆和结肠组织加样回收率均>90%，RSD<5%，可满足生物样品分析方法要求。
2.10 藥物动力学研究和大黄素结肠组织分布研究
根据测定的结果，采用3P87药代动力学计算程序对血药浓度时间数据进行拟合分析，算出大鼠给药后大黄素的药物动力学参数，结果见表2、表3，平均药时曲线见图3、图4。结果表明，经结肠靶向微丸给药后，大鼠血液和肠组织中所含大黄素的药物动力学参数T1/2、和Tmax较普通胶囊组有所延长，说明微丸进入大鼠体内分布和消除均较慢，具有一定的缓释作用；Cmax和AUC0-24较普通胶囊组明显提高，说明结肠靶向微丸通过结肠定位释放，可明显提高药物在结肠组织中大黄素的含量，从而有效提高药物的生物利用度。
3 讨论
口服结肠定位给药系统是通过口服达到结肠定位释放的目的，避免药物在胃的吸收，提高药物在结肠部位的局部浓度，充分发挥药物的治疗作用，降低药物的不良反应，提高易被胃酸破坏或被胰酶代谢药物（如蛋白质、多肽类大分子药物）的生物利用度[8]。
本试验通过考察大鼠给药后不同时间血液和结肠组织中大黄素的含量变化，说明药物在制备成结肠靶向微丸后，其主要有效成分大黄素的吸收明显滞后，在胃中稳定，几乎没有药物释放，而在结肠处大量释放药物，体现了口服结肠定位给药的典型特征。微丸组和普通胶囊组的药时曲线下降近似平行，说明两制剂在体内吸收后的变化基本相同，结肠靶向微丸主要在结肠部位释放，普通胶囊主要在胃中释放，达到了口服结肠定位的给药目的。
参考文献：
[1] Li Yong， Wang Lei， Su Chao， et al. Clinical observation on the treatment of chronic severe hepatitis B by retention enema with Huchang Jiedu Decoction[J]. Chin J Integr Med，2010，16（4）：348-352.
[2] 王磊，李勇，孙欢娜.肝病实脾验案[J].山东中医杂志，2012，31（1）：64-66.
[3] 李勇.病毒性肝炎的中医思维理念与思考[J].世界中医药，2008，3（1）：8-9.
[4] 熊兴富.中药大黄主要有效成分药理学研究进展[J].中医临床研究， 2014，6（10）：143-146.
[5] 冯俊光，吴先平，韦志军，等.大黄素对小鼠肠缺血/再灌注肺损伤的保护作用[J].新中医，2011，43（6）：130-131.
[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：22.
[7] 叶少梅，欧卫平.大鼠心脏取血法[J].上海实验动物科学，1999，19（3）：177.
[8] 郎美琦，黄佳盛.口服结肠定位给药系统的研究进展[J].中国药物与临床，2010，10（4）：441-443.
（收稿日期：2015-01-07；编辑：陈静）