【摘 要】
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目的 构建MT1F基因过表达重组质粒,并转染结肠癌细胞株.方法 Real-time聚合酶链反应(PCR)检测和筛选6株结肠癌细胞MT1F mRNA表达.采用全基因合成法合成MT1F编码区序列,分别克
【机 构】
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上海交通大学附属第一人民医院普外科,上海交通大学附属第一人民医院病理科
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目的 构建MT1F基因过表达重组质粒,并转染结肠癌细胞株.方法 Real-time聚合酶链反应(PCR)检测和筛选6株结肠癌细胞MT1F mRNA表达.采用全基因合成法合成MT1F编码区序列,分别克隆入pEGFP和pcDNA3.1(+)载体的C1末端,构建重组质粒pEGFP-Cl-MT1F和pcDNA3.1-MT1F,DNA测序,以500μl脂质体质粒复合物转染RKO细胞,G418(400 mg/L)维持筛选,Western blot(鼠抗人MT单抗1∶500、鼠抗GFP抗体1∶1000)等检测目的基因表达效率.结果 6株细胞中,RKO细胞MT1F mRNA水平最低.测序表明MT1F重组质粒构建成功.瞬时和稳定转染RKO细胞后,MT1F mRNA分别升高约600和2000倍,并表达15×103的MT蛋白.结论 成功构建MT1F基因过表达重组质粒,获得外源性MT1F稳定转染的结肠癌RKO细胞株.
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