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[摘要] 目的 研究中药复方健脾解毒方对裸鼠人肠癌血管新生的抑制作用。 方法 建立人肠癌COLO-205细胞裸鼠皮下移植瘤模型，随机分为5组：模型组（生理盐水组），健脾解毒方低、中、高剂量组[250、500、1000 mg/（kg·d）]和阿霉素组[1 mg/（kg·d）]。给药第21天，各组均处死荷瘤鼠，测量肿瘤大小及质量。免疫组化法检测瘤体的MVD和COX-2表达；ELISA测定血清中VEGF的表达。 结果 健脾解毒方低、中、高剂量组的瘤重抑制率分别为33.33%、36.54%、44.04%。免疫组化结果显示，模型组、健脾解毒方低、中、高剂量组瘤体MVD计数分别为63.67±3.21、50.33±4.51、47.00±3.00、34.67±4.51，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01）。ELISA结果显示，健脾解毒方低、中、高剂量组血清VEGF表达与模型组相比显著下调（P<0.01）。健脾解毒方能够下调瘤体中COX-2蛋白表达，并且呈一定剂量依赖效应。 结论 健脾解毒方对人肠癌皮下移植瘤生长和血管新生具有一定抑制作用，其机制可能与下调COX-2和VEGF表达有关。
[关键词] 健脾解毒方；结肠癌；血管新生；环氧化酶-2
[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）03-
大肠癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在我国乃至世界上呈逐年上升趋势[1-2]。目前以手术治疗为主，但复发转移率高，其主要原因是肿瘤血管新生导致肿瘤向其他脏器组织侵袭、转移。健脾解毒方由生黄芪、党参、白术、薏苡仁、猪苓、石见穿、野葡萄藤、八月札组成。实验研究表明，健脾解毒方能够抑制肿瘤细胞生长、诱导细胞凋亡、抗侵袭转移和逆转多药耐药等作用[3-6]。为了进一步探讨健脾解毒方对大肠癌的治疗作用，本研究通过建立裸鼠人肠癌皮下移植瘤模型，研究健脾解毒方对大肠癌的血管新生的抑制作用。
1 材料
1.1 细胞系
人肠癌COLO-205细胞系购自上海博谷生物科技有限公司。
1.2 动物
BALB/c裸小鼠，体质量18～20 g，雄性，SPF级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK（沪）2008-0016。
1.3 药物
中药复方健脾解毒方由上海中医药大学中药学院制备[7]（批号：100702）；阿霉素购自Pfizer Italia S.r.l （批号：8NB002-A）；山羊抗小鼠CD34单克隆抗体（美国R&D公司）；兔抗人COX-2单克隆抗体（美国CST公司）；VEGF ELISA试剂盒为上海博谷生物科技有限公司产品。
1.4 仪器
CKX41/U-RFLT50荧光倒置显微镜（日本OLYMPUS）；GalaxyS CO2培养箱（英国RS Biotech公司）；JY6001型天平（上海精科公司天平仪器厂）；5804R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。
2 方法
2.1 人肠癌细胞培养
人肠癌COLO-205细胞，用含10%的胎牛血清、1.5 g/L碳酸氢钠、1.5 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养液，置于体积分数5%CO2、饱和湿度、37℃孵箱中常规培养。
2.2 裸鼠人结肠癌移植瘤模型的建立及分组给药
2.3 肿瘤体积、相对肿瘤体积、相对肿瘤增值率和肿瘤抑制率的计算
2.4 免疫组化Envision法检测瘤体MVD的表达
组织块用福尔马林固定液固定，乙醇脱水至二甲苯透明，石蜡包埋，切片，抗原热修复，封闭，一抗孵育，二抗孵育，DAB显色，在显微镜下观察染色程度，自来水充分冲洗终止反应；复染，脱水，透明，常规树脂封片；每批染色均用已知的阳性切片做阳性对照，用PBS代替一抗做阴性对照。按照Banerji S 等[11]的方法，即在低倍视野（×100）下扫描整个瘤体组织切片，选择最密集的微血管标记区，低倍视野下确定微血管密集区后，然后在高倍镜下（×200）选取3个不重复视野进行计数，求其平均数即作为该标本的MVD值。统计微血管的标准：CD34阳性染色定位于血管内皮细胞，呈棕黄或棕褐色，黏膜组织内孤立的棕黄色或棕褐色内皮细胞或内皮细胞簇均计数为一个血管，肌层较厚及管腔红细胞数>8个的血管不被计数。
2.5 ELISA法检测裸鼠血清中VEGF表达
将裸鼠进行摘除眼球取血，离心得到血清后进行ELISA实验，测定血清中VEGF的表达情况。操作步骤按参照上海博谷生物科技有限公司提供的试剂盒说明书进行。将检测结果用ELISA标准曲线专用软件做出VEGF浓度的标准曲线，分别用标准曲线计算出各检测孔中VEGF的浓度。
2.6 免疫组化染色方法检测环氧化酶-2（Cyclooxygenase 2，COX-2）蛋白的表达
采用链霉素抗生素蛋白-过氧化酶（S-P）免疫组化染色法检测COX-2蛋白的表达。以已知阳性片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。计数采用双盲法。采用图像分析仪，结果判断标准为在细胞出现棕黄色颗粒状物为阳性标志。每张切片于高倍镜下（×200）任选10个视野，细胞数>1000个以上，随机观察10个高倍视野，阳性计数采用双盲法，以阳性率作为观察指标。阳性表达率=表达阳性细胞数/总细胞数×100%。
2.7 统计学处理
3 结果
3.1 健脾解毒方对裸鼠人肠癌的生长抑制作用
3.3 健脾解毒方对裸鼠人肠癌VEGF表达的影响
健脾解毒方低、中、高剂量组均能下调裸鼠血清中VEGF表达水平，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01），呈剂量依赖性。见表1。这表明，健脾解毒方能够抑制裸鼠人肠癌VEGF表达。 3.4 健脾解毒方对裸鼠人肠癌COX-2蛋白表达的影响
4 讨论
天然药、传统中药有许多药的活性成分具有抗肿瘤活性，在现代肿瘤治疗中的作用日益受到重视，吸引了许多科研工作者对传统中药的抗肿瘤药物结构功能、抗肿瘤机制进行深入细致的研究。抑制肿瘤血管新生已成为国内外研究的热点，研究发现不少中药或其有效成分是通过抑制血管新生发挥抗肿瘤作用的，如复方苦参注射液，丹参酮ⅡA，人参提取物人参皂苷Rg3等。本研究发现，健脾解毒方对人肠癌皮下移植瘤生长具有一定抑制作用，呈剂量依赖性；同时，健脾解毒方能够抑制肿瘤MVD形成和下调促血管生成因子VEGF表达。
COX-2是催化花生四烯酸（Arachidonic Acid）产生前列腺素（Prostaglandins，PGs）的关键限速酶之一，被称为“诱导型（inducible）”环氧合酶。COX-2属诱导型，被认为是“快速反应基因”，在正常组织中无表达，当细胞受到各种刺激因素包括生长因子、细胞因子、炎性介质等作用时，COX-2的表达迅速上调，PGE2是COX-2催化花生四烯酸生成的主要产物[15]。现已证实COX-2的过度表达与结直肠癌的发生发展密切相关，其主要通过合成致癌物质、促进肿瘤血管新生、抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤粘附与转移等多个环节促进肿瘤的发生发展。COX-2选择性抑制剂在体内及体外均能发挥很好的抗肿瘤作用。Tsujii M等[16]发现转染COX-2基因的CaCo-2结肠癌细胞株，在体外培养时产生的VEGF、Ang-2等血管生成因子量比未转染的细胞株增加4-8倍，而COX-2抑制剂可使其恢复基础水平。前期研究发现，COX-2/PGE2通过激活Wnt/β-catenin信号通路，上调VEGF表达，从而促进大肠癌血管新生[17]。本研究通过免疫组化检测瘤体COX-2蛋白表达，结果发现，健脾解毒方能够下调COX-2蛋白表达，这与前期研究发现健脾解毒方能够抑制肿瘤血管新生和下调COX-2表达结果相一致[18-19]，说明健脾解毒方可能通过下调COX-2和VEGF表达抑制大肠癌血管新生。该实验研究结果与Zhou LH等[13]丹参酮ⅡA可能通过COX-2途径抑制C26结肠癌移植瘤模型MVD形成和下调血清中VEGF表达的观点一致。
综上所述，健脾解毒方能够抑制人肠癌裸鼠皮下移植瘤的生长和MVD形成，其机制可能是通过调控COX-2表达抑制VEGF而发挥作用，详细机制有待进一步研究。
[参考文献]
[1] Ahmedin JD，Freddie Bray，Melissa M，et al.Global Cancer Statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.
[2] 王赛特.大肠癌已成为第二大常见肿瘤[N].解放日报，2008-4-22（13）.
[3] 吴琼，王炎，周利红，等.健脾解毒方治疗裸鼠胃癌及其诱导胃癌细胞凋亡的研究[J].山西中医学院学报，2010，11（3）：16-20.
[4] 刘宁宁，王炎，周利红，等.健脾解毒方对幽门螺杆菌诱发胃癌血管新生的抑制研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（1）：88-92，95.
[5] 许建华，范忠泽，孙珏，等.肠胃清抗结肠癌转移的机制研究[J].中国中医药科技，2006，13（3）：148-150.
[6] 李琦，隋华，刘宣，等.健脾解毒方介导JNK/SAPK信号通路调控人结肠癌细胞多药耐药.中华中医药杂志.2012，27（3）：731-735.
[7] 金旻逸，丁越，张彤，等.肠胃清颗粒提取工艺研究[J].亚太传统医药，2011，7（2）：20-23.
[8] Yu SC，Chan CT.Transarterial ethanol of cirrhotic liver with lipiodol-ethanol mixture safety and efficacy study in rats[J].Invest Radiol，2006，41（8）：609-617.
[9] Minamimura T，Sato H，Kasaoka S，et a1. Tumor regression by inductive hyperthermia combined with hepatic embolization using dextran magnetite-incorporated microspheres in rats[J].Int J Oncol，2000，16（6）：1153-1158.
[10] Wu HP，Feng GS，Liang HM，et a1.Vascular endothelial growth factor antisense oligodeoxynucleotides with lipiodol in arterial embolization of liver cancer in rats[J].World J Gastroenterol，2004，10（6）：813-818.
[11] Banerji S，Ni J，Wang SX，et al.LYVE-1，a new homologue of the CD44 glycoprotein， is a lymph-specific receptor for hyaluronan[J].J Cell Biol，1999，144（4）：789-801.
[12] 李敏，钱晓萍，刘宝瑞.奥沙利铂联合复方苦参注射液抗血管生成作用的实验研究[J].中国癌症杂志，2008，18（3）：167-171.
[13] Zhou LH，Hu Q，Sui H，et al.Tanshinone II-A Inhibits Angiogenesis through Down Regulation of COX-2 in Human Colorectal Cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev，2012，13（9）：4453-4458.
[14] Xu TM，Xin Y，Cui MH，et al.Inhibitory effect of ginsenoside Rg3 combined with cyclophosphamide on growth and angiogenesis of ovarian cancer[J].Chin Med J（Engl），2007，120（7）：584-588.
[15] Jia RP，Xu LW，Su Q，et al. Cyclooxygenase-2 expression is dependent upon epidermal growth factor receptor expression or activation in androgen independent prostate cancer[J].Asian J Androl，2008，10（5）：758-764.
[16] Tsujii M，Kawano S，Tsuji S，et al. Cyclooxygenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cells[J]. Cell，1998，93（5）：705-716.
[17] 刘宣，李丹光泽，周利红，等.PGE2/COX-2激活Wnt/β-catenin信号通路调控人肠癌细胞VEGF表达[J].第二军医大学学报，2012，33（11）：1178-1181.
[18] 刘宁宁，王炎，吴琼，等.健脾解毒方介导p38MAPK/ATF-2信号通路抑制幽门螺杆菌诱导的人胃癌细胞COX-2表达[J].中国中西医结合杂志，2011，31（7）：926-931.
[19] 刘宁宁，周利红，殷佩浩，等.健脾解毒方对幽门螺杆菌诱发胃癌过程微血管密度及环氧合酶表达的影响[J].中国中西医结合杂志，2011，31（5）：647-652.
（收稿日期：2013-01-07）
[关键词] 健脾解毒方；结肠癌；血管新生；环氧化酶-2
[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）03-
大肠癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在我国乃至世界上呈逐年上升趋势[1-2]。目前以手术治疗为主，但复发转移率高，其主要原因是肿瘤血管新生导致肿瘤向其他脏器组织侵袭、转移。健脾解毒方由生黄芪、党参、白术、薏苡仁、猪苓、石见穿、野葡萄藤、八月札组成。实验研究表明，健脾解毒方能够抑制肿瘤细胞生长、诱导细胞凋亡、抗侵袭转移和逆转多药耐药等作用[3-6]。为了进一步探讨健脾解毒方对大肠癌的治疗作用，本研究通过建立裸鼠人肠癌皮下移植瘤模型，研究健脾解毒方对大肠癌的血管新生的抑制作用。
1 材料
1.1 细胞系
人肠癌COLO-205细胞系购自上海博谷生物科技有限公司。
1.2 动物
BALB/c裸小鼠，体质量18～20 g，雄性，SPF级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK（沪）2008-0016。
1.3 药物
中药复方健脾解毒方由上海中医药大学中药学院制备[7]（批号：100702）；阿霉素购自Pfizer Italia S.r.l （批号：8NB002-A）；山羊抗小鼠CD34单克隆抗体（美国R&D公司）；兔抗人COX-2单克隆抗体（美国CST公司）；VEGF ELISA试剂盒为上海博谷生物科技有限公司产品。
1.4 仪器
CKX41/U-RFLT50荧光倒置显微镜（日本OLYMPUS）；GalaxyS CO2培养箱（英国RS Biotech公司）；JY6001型天平（上海精科公司天平仪器厂）；5804R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。
2 方法
2.1 人肠癌细胞培养
人肠癌COLO-205细胞，用含10%的胎牛血清、1.5 g/L碳酸氢钠、1.5 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养液，置于体积分数5%CO2、饱和湿度、37℃孵箱中常规培养。
2.2 裸鼠人结肠癌移植瘤模型的建立及分组给药
2.3 肿瘤体积、相对肿瘤体积、相对肿瘤增值率和肿瘤抑制率的计算
2.4 免疫组化Envision法检测瘤体MVD的表达
组织块用福尔马林固定液固定，乙醇脱水至二甲苯透明，石蜡包埋，切片，抗原热修复，封闭，一抗孵育，二抗孵育，DAB显色，在显微镜下观察染色程度，自来水充分冲洗终止反应；复染，脱水，透明，常规树脂封片；每批染色均用已知的阳性切片做阳性对照，用PBS代替一抗做阴性对照。按照Banerji S 等[11]的方法，即在低倍视野（×100）下扫描整个瘤体组织切片，选择最密集的微血管标记区，低倍视野下确定微血管密集区后，然后在高倍镜下（×200）选取3个不重复视野进行计数，求其平均数即作为该标本的MVD值。统计微血管的标准：CD34阳性染色定位于血管内皮细胞，呈棕黄或棕褐色，黏膜组织内孤立的棕黄色或棕褐色内皮细胞或内皮细胞簇均计数为一个血管，肌层较厚及管腔红细胞数>8个的血管不被计数。
2.5 ELISA法检测裸鼠血清中VEGF表达
将裸鼠进行摘除眼球取血，离心得到血清后进行ELISA实验，测定血清中VEGF的表达情况。操作步骤按参照上海博谷生物科技有限公司提供的试剂盒说明书进行。将检测结果用ELISA标准曲线专用软件做出VEGF浓度的标准曲线，分别用标准曲线计算出各检测孔中VEGF的浓度。
2.6 免疫组化染色方法检测环氧化酶-2（Cyclooxygenase 2，COX-2）蛋白的表达
采用链霉素抗生素蛋白-过氧化酶（S-P）免疫组化染色法检测COX-2蛋白的表达。以已知阳性片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。计数采用双盲法。采用图像分析仪，结果判断标准为在细胞出现棕黄色颗粒状物为阳性标志。每张切片于高倍镜下（×200）任选10个视野，细胞数>1000个以上，随机观察10个高倍视野，阳性计数采用双盲法，以阳性率作为观察指标。阳性表达率=表达阳性细胞数/总细胞数×100%。
2.7 统计学处理
3 结果
3.1 健脾解毒方对裸鼠人肠癌的生长抑制作用
3.3 健脾解毒方对裸鼠人肠癌VEGF表达的影响
健脾解毒方低、中、高剂量组均能下调裸鼠血清中VEGF表达水平，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01），呈剂量依赖性。见表1。这表明，健脾解毒方能够抑制裸鼠人肠癌VEGF表达。 3.4 健脾解毒方对裸鼠人肠癌COX-2蛋白表达的影响
4 讨论
天然药、传统中药有许多药的活性成分具有抗肿瘤活性，在现代肿瘤治疗中的作用日益受到重视，吸引了许多科研工作者对传统中药的抗肿瘤药物结构功能、抗肿瘤机制进行深入细致的研究。抑制肿瘤血管新生已成为国内外研究的热点，研究发现不少中药或其有效成分是通过抑制血管新生发挥抗肿瘤作用的，如复方苦参注射液，丹参酮ⅡA，人参提取物人参皂苷Rg3等。本研究发现，健脾解毒方对人肠癌皮下移植瘤生长具有一定抑制作用，呈剂量依赖性；同时，健脾解毒方能够抑制肿瘤MVD形成和下调促血管生成因子VEGF表达。
COX-2是催化花生四烯酸（Arachidonic Acid）产生前列腺素（Prostaglandins，PGs）的关键限速酶之一，被称为“诱导型（inducible）”环氧合酶。COX-2属诱导型，被认为是“快速反应基因”，在正常组织中无表达，当细胞受到各种刺激因素包括生长因子、细胞因子、炎性介质等作用时，COX-2的表达迅速上调，PGE2是COX-2催化花生四烯酸生成的主要产物[15]。现已证实COX-2的过度表达与结直肠癌的发生发展密切相关，其主要通过合成致癌物质、促进肿瘤血管新生、抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤粘附与转移等多个环节促进肿瘤的发生发展。COX-2选择性抑制剂在体内及体外均能发挥很好的抗肿瘤作用。Tsujii M等[16]发现转染COX-2基因的CaCo-2结肠癌细胞株，在体外培养时产生的VEGF、Ang-2等血管生成因子量比未转染的细胞株增加4-8倍，而COX-2抑制剂可使其恢复基础水平。前期研究发现，COX-2/PGE2通过激活Wnt/β-catenin信号通路，上调VEGF表达，从而促进大肠癌血管新生[17]。本研究通过免疫组化检测瘤体COX-2蛋白表达，结果发现，健脾解毒方能够下调COX-2蛋白表达，这与前期研究发现健脾解毒方能够抑制肿瘤血管新生和下调COX-2表达结果相一致[18-19]，说明健脾解毒方可能通过下调COX-2和VEGF表达抑制大肠癌血管新生。该实验研究结果与Zhou LH等[13]丹参酮ⅡA可能通过COX-2途径抑制C26结肠癌移植瘤模型MVD形成和下调血清中VEGF表达的观点一致。
综上所述，健脾解毒方能够抑制人肠癌裸鼠皮下移植瘤的生长和MVD形成，其机制可能是通过调控COX-2表达抑制VEGF而发挥作用，详细机制有待进一步研究。
[参考文献]
[1] Ahmedin JD，Freddie Bray，Melissa M，et al.Global Cancer Statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.
[2] 王赛特.大肠癌已成为第二大常见肿瘤[N].解放日报，2008-4-22（13）.
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[4] 刘宁宁，王炎，周利红，等.健脾解毒方对幽门螺杆菌诱发胃癌血管新生的抑制研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（1）：88-92，95.
[5] 许建华，范忠泽，孙珏，等.肠胃清抗结肠癌转移的机制研究[J].中国中医药科技，2006，13（3）：148-150.
[6] 李琦，隋华，刘宣，等.健脾解毒方介导JNK/SAPK信号通路调控人结肠癌细胞多药耐药.中华中医药杂志.2012，27（3）：731-735.
[7] 金旻逸，丁越，张彤，等.肠胃清颗粒提取工艺研究[J].亚太传统医药，2011，7（2）：20-23.
[8] Yu SC，Chan CT.Transarterial ethanol of cirrhotic liver with lipiodol-ethanol mixture safety and efficacy study in rats[J].Invest Radiol，2006，41（8）：609-617.
[9] Minamimura T，Sato H，Kasaoka S，et a1. Tumor regression by inductive hyperthermia combined with hepatic embolization using dextran magnetite-incorporated microspheres in rats[J].Int J Oncol，2000，16（6）：1153-1158.
[10] Wu HP，Feng GS，Liang HM，et a1.Vascular endothelial growth factor antisense oligodeoxynucleotides with lipiodol in arterial embolization of liver cancer in rats[J].World J Gastroenterol，2004，10（6）：813-818.
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[12] 李敏，钱晓萍，刘宝瑞.奥沙利铂联合复方苦参注射液抗血管生成作用的实验研究[J].中国癌症杂志，2008，18（3）：167-171.
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[14] Xu TM，Xin Y，Cui MH，et al.Inhibitory effect of ginsenoside Rg3 combined with cyclophosphamide on growth and angiogenesis of ovarian cancer[J].Chin Med J（Engl），2007，120（7）：584-588.
[15] Jia RP，Xu LW，Su Q，et al. Cyclooxygenase-2 expression is dependent upon epidermal growth factor receptor expression or activation in androgen independent prostate cancer[J].Asian J Androl，2008，10（5）：758-764.
[16] Tsujii M，Kawano S，Tsuji S，et al. Cyclooxygenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cells[J]. Cell，1998，93（5）：705-716.
[17] 刘宣，李丹光泽，周利红，等.PGE2/COX-2激活Wnt/β-catenin信号通路调控人肠癌细胞VEGF表达[J].第二军医大学学报，2012，33（11）：1178-1181.
[18] 刘宁宁，王炎，吴琼，等.健脾解毒方介导p38MAPK/ATF-2信号通路抑制幽门螺杆菌诱导的人胃癌细胞COX-2表达[J].中国中西医结合杂志，2011，31（7）：926-931.
[19] 刘宁宁，周利红，殷佩浩，等.健脾解毒方对幽门螺杆菌诱发胃癌过程微血管密度及环氧合酶表达的影响[J].中国中西医结合杂志，2011，31（5）：647-652.
（收稿日期：2013-01-07）