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[摘要] 目的 探讨黄芪及黄芪多糖对隐孢子虫感染的免疫抑制小鼠的肠道局部粘膜免疫的调节作用。 方法 用醋酸地赛米松给Balb/c小鼠灌胃8 d，第9天接种1×106个隐孢子虫卵囊，建立免疫抑制小鼠隐孢子虫感染模型。再经黄芪水煎剂及黄芪多糖灌胃治疗10 d，并设正常对照组、模型对照组和乙酰螺旋霉素对照组。每日计数小鼠粪便中隐孢子虫卵囊的数量，于实验第20天，光学显微镜观察肠组织病理学改变，ELISA法测定肠组织匀浆上清IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ水平及小肠黏液SIgA，流式细胞仪检测肠黏膜上皮细胞下T细胞亚群。 结果 与模型组比较，黄芪水煎剂组、黄芪多糖组和乙酰螺旋霉素组小鼠卵囊排出数量减少，肠组织病理学改变较轻，免疫学检测发现CD4+、CD8+淋巴细胞数量、小肠黏液SIgA及肠组织匀浆上清IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ的水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 黄芪水煎剂及黄芪多糖通过上调肠道黏膜局部免疫功能促进隐孢子虫感染小鼠恢复。
[关键词] 黄芪；黄芪多糖；隐孢子虫；黏膜免疫
[中图分类号] R967 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）03-
隐孢子虫病是一种世界范围内的人畜共患病，流行遍布90多个国家，是世界最常见的6大腹泻病因之一[1]。艾滋病患者隐孢子虫感染率可达48%，是其致死重要因素[2-4]。隐孢子虫感染和致病已经成为人类健康和公共卫生安全的重大威胁，同时也对畜牧经济发展产生严重危害。隐孢子虫易致免疫功能低下或缺陷者严重感染，提示隐孢子虫致病与机体免疫力有重要关系。黄芪具有补气固表、利水退肿、脱毒排脓、生肌等功效，中医用于治疗气虚乏力，食少便溏等。本项研究采用醋酸地塞米松致免疫低下的隐孢子虫感染的小鼠模型，探讨黄芪水煎剂及黄芪多糖对隐孢子虫感染的肠道局部免疫反应的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.2 一般状况观察 称量小鼠体重，观察动物的活动、毛色、摄食等。
1.2.3 粪便中卵囊计数 按照文献[8，9]叙述方法，每天收集小鼠粪便，以饱和糖水溶液悬浮隐孢子虫卵囊，孔雀绿染液染色计数每克粪便中卵囊个数。
1.2.4 组织学观察 取小鼠幽门下十二指肠上段约1 cm的组织块，置中性福尔马林固定液中。修块、石蜡包埋、切片、HE染色、镜检、记录、显微照像。
1.2.5 肠上皮内淋巴细胞的分离和检测 取从幽门至回盲部的小肠，用含有5%小牛血清D-Hank’s液冲洗并翻转，置含有15 mL消化液的离心管中37℃孵育40 min，充分震荡后，300目尼龙滤网过滤、离心，70%和40%双层percoll密度梯度离心后，收集70%与40%Percoll之间的细胞，流式细胞仪检测CD4+、CD8+T细胞数量的变化。
1.2.6 小肠黏液SIgA测定 取靠近回盲部1.5 cm的长段，用载玻片轻刮粘膜表面粘液至小试管中，加入PBS 0.5 mL ，离心后吸取上清，-20°C保存待测。sIgA的检测采用ELISA法，具体操作按试剂盒说明书进行。
1.3 统计学处理
2 结果
2.1 小鼠一般状态
模型组小鼠接受地塞米松诱导后，出现体重下降、行动迟缓、体毛疏松、摄食减少，偶有腹泻。正常对照组小鼠体重稍有增加、活泼好动，其他组小鼠变化不明显。
2.2 粪便中卵囊排出规律
3 讨论
隐孢子虫属于机会致病性寄生虫，通常不引起免疫力正常的个体发生感染，只有当人体免疫力降低时，如患艾滋病时，才具有异常的致病力，导致患者出现明显的临床症状和体征，甚至危及生命。隐孢子虫卵囊经口感染后主要寄生在小肠黏膜上皮细胞内，因而，肠黏膜局部免疫在隐孢子虫感染中意义重大。
目前用于治疗隐孢子虫感染的化学药物主要有叶酸盐拮抗剂、磺胺硝苯、甲氧苄氨嘧啶，抗生素主要有氨基糖苷类、大环内酯类。但是都不能从根本上杀死虫体，并能引起副作用[10]。所以，探索中医药对隐孢子虫感染的治疗很有必要。黄芪是扶正固本的传统中药材，已经有实验证实黄芪能增强机体免疫功能的报道。本研究探讨的是黄芪及黄芪多糖是否能够通过调节免疫抑制小鼠肠道局部黏膜免疫而促进隐孢子虫感染的恢复。
从实验结果可见，黄芪水煎剂组小鼠健康、活泼，病理观察肠道黏膜恢复好，说明黄芪确实能促进隐孢子虫感染的免疫低下小鼠的恢复。进一步检测发现黄芪水煎剂组小鼠肠道SIgA水平、黏膜下CD4+细胞及肠组织匀浆上清细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α的水平与模型组相比较，均明显升高（P<0.05），而黄芪多糖组小鼠与黄芪水煎剂组小鼠相比较差异无统计学意义（P>0.05），提示黄芪多糖是黄芪水煎剂中促进黏膜免疫的主要成分。
[参考文献]
[1] Natividad FF，Buerano CC，Lago CB，et al.Prevalence rates of Giardia and Cryptosporidium among diarrheic patients in the Philippines[J].Southeast Asian J Trop Med Public Health，2008，39（6）：991-999.
[2] Cama V，Gilman RH，Vivar A，et al.Mixed Cryptosporidium infections and HIV[J].Emerg Infect Dis，2006，12（6）：1025-1028.
[3] Zaidah AR，Chan YY，Asma HS，et al.Detection of Cryptosporidium parvum in HIV-infected patients in Malaysia using a molecular approach[J].Southeast Asia J Trop Med Public Health，2008，39（3）：511-516.
[4] Cama VA，Ross JM，Crawford S，et al.Differences in clinical manifestations among Cryptosporidium species and subtypes in HIV-infected persons[J].J Infect Dis，2007，196（5）：684-691.
[5] 孙仕玲.山药多糖含量的测定方法研究[J].农业与技术，2010，30（3）：35-39.
[6] 胡长玉，徐有志.祁白术多糖提取工艺研究[J].生物学杂志，2010， 27（4）：57-59.
[7] 应超，李秀英，金小翠，等.补骨脂及双氢蒿素杀灭隐孢子虫的观察[J].中国人兽共患病学报，2010，26（4）：360-363.
[8] 杨光，周天鸿，李月琴，等.应用巢氏PCR方法诊断微小隐孢子虫感染的实验研究[J].中国热带医学杂志，2008，8（11）：1109-1111.
[9] 王进产，陈丹，张龙现，等.人源隐孢子虫小白鼠感染模型的建立[J].疾病防治中国畜牧兽医，2006，33（6）：56-59.
[10] White CA Jr.Nitazoxanide： a new broad spectrum antiparasitic agent[J].Expert Rev Anti Infect Ther，2004，2（1）：43-49.
（收稿日期：2012-12-06）
[关键词] 黄芪；黄芪多糖；隐孢子虫；黏膜免疫
[中图分类号] R967 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）03-
隐孢子虫病是一种世界范围内的人畜共患病，流行遍布90多个国家，是世界最常见的6大腹泻病因之一[1]。艾滋病患者隐孢子虫感染率可达48%，是其致死重要因素[2-4]。隐孢子虫感染和致病已经成为人类健康和公共卫生安全的重大威胁，同时也对畜牧经济发展产生严重危害。隐孢子虫易致免疫功能低下或缺陷者严重感染，提示隐孢子虫致病与机体免疫力有重要关系。黄芪具有补气固表、利水退肿、脱毒排脓、生肌等功效，中医用于治疗气虚乏力，食少便溏等。本项研究采用醋酸地塞米松致免疫低下的隐孢子虫感染的小鼠模型，探讨黄芪水煎剂及黄芪多糖对隐孢子虫感染的肠道局部免疫反应的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.2 一般状况观察 称量小鼠体重，观察动物的活动、毛色、摄食等。
1.2.3 粪便中卵囊计数 按照文献[8，9]叙述方法，每天收集小鼠粪便，以饱和糖水溶液悬浮隐孢子虫卵囊，孔雀绿染液染色计数每克粪便中卵囊个数。
1.2.4 组织学观察 取小鼠幽门下十二指肠上段约1 cm的组织块，置中性福尔马林固定液中。修块、石蜡包埋、切片、HE染色、镜检、记录、显微照像。
1.2.5 肠上皮内淋巴细胞的分离和检测 取从幽门至回盲部的小肠，用含有5%小牛血清D-Hank’s液冲洗并翻转，置含有15 mL消化液的离心管中37℃孵育40 min，充分震荡后，300目尼龙滤网过滤、离心，70%和40%双层percoll密度梯度离心后，收集70%与40%Percoll之间的细胞，流式细胞仪检测CD4+、CD8+T细胞数量的变化。
1.2.6 小肠黏液SIgA测定 取靠近回盲部1.5 cm的长段，用载玻片轻刮粘膜表面粘液至小试管中，加入PBS 0.5 mL ，离心后吸取上清，-20°C保存待测。sIgA的检测采用ELISA法，具体操作按试剂盒说明书进行。
1.3 统计学处理
2 结果
2.1 小鼠一般状态
模型组小鼠接受地塞米松诱导后，出现体重下降、行动迟缓、体毛疏松、摄食减少，偶有腹泻。正常对照组小鼠体重稍有增加、活泼好动，其他组小鼠变化不明显。
2.2 粪便中卵囊排出规律
3 讨论
隐孢子虫属于机会致病性寄生虫，通常不引起免疫力正常的个体发生感染，只有当人体免疫力降低时，如患艾滋病时，才具有异常的致病力，导致患者出现明显的临床症状和体征，甚至危及生命。隐孢子虫卵囊经口感染后主要寄生在小肠黏膜上皮细胞内，因而，肠黏膜局部免疫在隐孢子虫感染中意义重大。
目前用于治疗隐孢子虫感染的化学药物主要有叶酸盐拮抗剂、磺胺硝苯、甲氧苄氨嘧啶，抗生素主要有氨基糖苷类、大环内酯类。但是都不能从根本上杀死虫体，并能引起副作用[10]。所以，探索中医药对隐孢子虫感染的治疗很有必要。黄芪是扶正固本的传统中药材，已经有实验证实黄芪能增强机体免疫功能的报道。本研究探讨的是黄芪及黄芪多糖是否能够通过调节免疫抑制小鼠肠道局部黏膜免疫而促进隐孢子虫感染的恢复。
从实验结果可见，黄芪水煎剂组小鼠健康、活泼，病理观察肠道黏膜恢复好，说明黄芪确实能促进隐孢子虫感染的免疫低下小鼠的恢复。进一步检测发现黄芪水煎剂组小鼠肠道SIgA水平、黏膜下CD4+细胞及肠组织匀浆上清细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α的水平与模型组相比较，均明显升高（P<0.05），而黄芪多糖组小鼠与黄芪水煎剂组小鼠相比较差异无统计学意义（P>0.05），提示黄芪多糖是黄芪水煎剂中促进黏膜免疫的主要成分。
[参考文献]
[1] Natividad FF，Buerano CC，Lago CB，et al.Prevalence rates of Giardia and Cryptosporidium among diarrheic patients in the Philippines[J].Southeast Asian J Trop Med Public Health，2008，39（6）：991-999.
[2] Cama V，Gilman RH，Vivar A，et al.Mixed Cryptosporidium infections and HIV[J].Emerg Infect Dis，2006，12（6）：1025-1028.
[3] Zaidah AR，Chan YY，Asma HS，et al.Detection of Cryptosporidium parvum in HIV-infected patients in Malaysia using a molecular approach[J].Southeast Asia J Trop Med Public Health，2008，39（3）：511-516.
[4] Cama VA，Ross JM，Crawford S，et al.Differences in clinical manifestations among Cryptosporidium species and subtypes in HIV-infected persons[J].J Infect Dis，2007，196（5）：684-691.
[5] 孙仕玲.山药多糖含量的测定方法研究[J].农业与技术，2010，30（3）：35-39.
[6] 胡长玉，徐有志.祁白术多糖提取工艺研究[J].生物学杂志，2010， 27（4）：57-59.
[7] 应超，李秀英，金小翠，等.补骨脂及双氢蒿素杀灭隐孢子虫的观察[J].中国人兽共患病学报，2010，26（4）：360-363.
[8] 杨光，周天鸿，李月琴，等.应用巢氏PCR方法诊断微小隐孢子虫感染的实验研究[J].中国热带医学杂志，2008，8（11）：1109-1111.
[9] 王进产，陈丹，张龙现，等.人源隐孢子虫小白鼠感染模型的建立[J].疾病防治中国畜牧兽医，2006，33（6）：56-59.
[10] White CA Jr.Nitazoxanide： a new broad spectrum antiparasitic agent[J].Expert Rev Anti Infect Ther，2004，2（1）：43-49.
（收稿日期：2012-12-06）