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摘要：基因组编辑包括基因组的各种编辑，如短插入和短删除、替换和染色体重排，包括逆序、重复和易位。这些变异是基于单链或多链DNA双链断裂（DSB）触发的细胞修复机械。除了这些传统的基因组编辑策略之外，能够对特定核酸序列进行自定义、位点特异性识别的工具也得到了更广泛的应用：如不引入DSB的单碱基编辑、添加表观遗传学修饰剂的表观基因组编辑、使用RNA编辑系统的转录组工程、特异DNA和RNA序列的体外检测等。在这篇综述中，我们简要介绍了基因组编辑和相关技术的现状，这些技术为癌症科学做出了多方面的贡献。
关键词：基础编辑;癌症科学;CRISPR-Cas9;基因组编辑;转录组编辑;
【中图分类号】R246.5 【文献标识码】A 【文章编号】2026-5328（2021）05-124-03
Abstract：Genome editing includes various edits of the genome， such as short insertions and deletions， substitutions and chromosomal rearrangements including inversions， duplications and translocations. These variations are based on single or multiple DNA double-strand break （DSB）-triggered in cellulo repair machineries. In addition to these “conventional” genome editing strategies， tools enabling customized， site-specific recognition of particular nucleic acid sequences have been coming into wider use： for example， single base editing without DSB introduction， epigenome editing with recruitment of epigenetic modifiers， transcriptome engineering using RNA editing systems， and in vitro detection of specific DNA and RNA sequences. In this review， we provide a quick overview of the current state of genome editing and related technologies that multilaterally contribute to cancer science.
Key words： base editing; cancer science; CRISPR-Cas9; genome editing; transcriptome editing;
1.介紹
基因的定义是遗传信息的一个单位，这是一个相当概念化的术语。在活细胞中，有编码基因和非编码基因，分别作为蛋白质和RNA发挥作用。基因可以在体外用于各种目的，包括无细胞转录和翻译的创造，以及遗传疾病、癌症和传染病的诊断。
基因组编辑工具可以设计具有可定制DNA结合和裂解特性的基因，这些特性适用于活细胞和有机体。它们对于基因组DNA的序列改变无疑是有用的，可以进行简单的基因敲除和敲入，也可以进行更为复杂的编辑。然而，考虑到上述基因的众多特点，基因的编辑技术也变得多样化。事实上，在过去的几年中，各种方法和技术得到了迅速发展、改进，并以各种方式得到了应用。
2.基因组编辑的衍生技术
由于基因组编辑领域技术的飞速发展，使得该领域的研究很难保持与时俱进。到目前为止，已有课题组发表了许多关于基因组编辑的评论，其中包含了每次发表时可以获得的最新信息。例如，大纲的这项技术包括历史背景综述了2014年，集中审查CRISPR-Cas9于2015年出版[1]，以及转录激活子样效应子（TALE）核酸酶（TALEN）系统的全面概述[2]。在这些回顾中，介绍了各项技术发展成就包括高度活跃的TALE/TALEN变体，名为Platinum TALE/TALEN。
之前报道了一些重要的创新，如具有更广泛PAM特异性的xCas9， HypaCas9和桥接核酸结合CRISPR RNA[3]用于超准确的DNA识别，以及Cas9-HE用于高效的同源依赖修复。此外，在2018年开发的DSB修复分子（LoAD）局部积累系统，该系统支持修复通路偏向的基因组编辑[4]。在转录激活子样效应核酸酶（TALEN）系统中，传统的TALEN包含恒定重复，没有非重复可变双残基（非RVD）变异而该课题组改良的TALEN包含非RVD变异的可变重复，导致更高的核酸酶活性。
3. 技术理论
3.1 单碱基对编辑
碱基编辑是一种较新的基因组编辑方法，它使用CRISPR系统的组件和其他酶直接将点突变安装到细胞DNA或RNA中，而不会造成双链DNA断裂。
单碱基对编辑是一种用于疾病建模和校正的基因组序列的精细而重要的修饰方法。各种依赖于DBS介导的传统基因组编辑的复杂策略已经被报道并且在这一领域正在不断发展。最近的一个例子是微同源介导的末端连接（MMEJ）依赖策略，称为MhAX[5]，实现了一种MMEJ依赖的基因编辑策略，称为音高系统，在盒式磁带切除。
单碱基对编辑的基本概念是胞嘧啶脱氨酶介导胞嘧啶转化为尿嘧啶，然后是胸腺嘧啶。胞苷脱氨酶，如APOBEC1，与dCas9或Cas9n （Cas9 nickase）结合，靶向特定的基因组位点。单碱基对编辑系统的适用性最初在酵母和哺乳动物细胞中被证实[6]，然后是各种生物体，包括植物，老鼠，海胆和细菌[7]。 3.2 全基因組筛查
基因组编辑核酸酶通常用于逆向遗传学，但《科学与自然生物技术》上发表的三篇里程碑式论文开创了CRISPR介导的正向遗传学的新时代[8]，慢病毒RNAi筛选系统被CRISPR-Cas9所取代。将全基因组慢病毒单指南RNA（sgRNA）文库汇集并感染培养细胞，进行预期的抗肿瘤药物耐药性，并通过下一代测序分析富集的sgRNA。近年来，基于CRISPR/ Cas9的联合筛选方法迅速改变了功能基因组学领域。突变体的容易产生、较低的靶外效应和Cas9蛋白的工程通用性通常使全基因组CRISPR/Cas9为基础的筛选优于大规模的RNAi筛选。
在癌症科学的背景下，以下强调使用全基因组筛选的几个关键研究。第一项研究是肿瘤生长和转移相关基因的体外筛选 [9]，分被引入非转移性小鼠癌细胞，然后移植到成年小鼠中，筛选肿瘤生长和转移相关突变。第二项研究是一系列报道长非编码RNA（lncRNA）筛选的研究。最近的一项研究发现了lncRNAs的多样性，并推测数千个lncRNAs与人类疾病有关[10]。
汇集的全基因组筛选虽然有助于推断生物功能，但不能根据其转录状态提供关于细胞状态的详细信息。在传统的CRISPR/Cas9合用屏幕上，读出的只是细胞池中包含的大量gRNA序列，无法有效地提供所需的分辨率来进行综合表型。
3.3 DNA条码和记录
正如已经介绍过的那样，具有反向和正向遗传学的基因组编辑显著促进了癌症的特征描述;然而，从临床肿瘤学的观点来看，癌症进化所产生的大量突变使事情变得极其复杂。们将获得一个强大的武器来应对这一巨大的挑战，它们可以大致分为两种策略：DNA条码和记录。
格式塔法将条形码整合到能够引入多种突变模式的基因组中，实现了斑马鱼的整个有机体谱系追踪[11]。通过测序分析了条形码中独立引入和进化的突变模式，从而实现了谱系追踪。
3.4 转录控制和表观基因组编辑
虽然每一种方法都是可变的，但是上面介绍的所有技术都伴随着DNA序列的改变。相反，控制基因表达或操纵表观遗传修饰也可以在不改变DNA序列的情况下调节表型。
首先，之前报道的整合的多倍腺病毒CRISPRi载体，同时携带融合了转录抑制域、KRAB和多个sgRNA的dCas9，在培养细胞和体内有效地显示了抗肿瘤作用。其次，以TALE为基础的转录因子和表观遗传修饰因子也是该领域很有前途的工具。相关研究表明，只要加入一种与转录激活域和细胞穿透肽融合的重组铂层蛋白，就可以实现诱导多能干细胞的重编程[12]。
3.5 其他新兴技术：RNA靶向和编辑、基于CRISPR的诊断和邻近标记
在转录组编辑和体外诊断方面，RNA引导的RNA靶向酶Cas13是一个值得关注的系统。据报道，Cas13可用于基因敲除和靶向RNA结合，用于转录的活细胞跟踪。通过使用其他Cas蛋白质如CsrX显示了类似的应用。Cas13进一步被用于病毒核酸的诊断和无细胞DNA的癌症检测。最初的系统被称为SHERLOCK，它能够从数量有限的靶DNA和RNA中进行低成本、高灵敏度和鲁棒的检测[13]。
GloPro和C-BERST均可实现dCas9-APEX介导的靶向基因组DNA区域邻近标记，用于位点特异性蛋白组学[14]。之前的系统称为工程染色质免疫沉淀（enChIP），其基础是标记的dCas9介导的沉淀[15]; 然而，这些新系统在生物素-苯酚和H2O2存在的情况下，仅通过sgRNA表达dCas9-APEX，很容易对近端蛋白进行生物酰化。这些技术还应该有助于癌症相关基因启动子/增强子区域的蛋白质组学分析。
4.结论
我们相信，DSB介导的标准基因组编辑是一项改变世界的技术，毫无疑问，它极大地改变了包括癌症科学在内的生命科学研究。然而，除此之外，许多新技术目前正在等待机会来创建一个范式转移（或者可能是多个范式转移）。为了充分利用这些新兴技术，我们必须密切关注它们。
在另一方面，最近的调查警告了在应用CRISPR-Cas9时发生肿瘤的风险、意外的异质性和可变的目标编辑结果。随着基因组编辑应用的急剧增加，安全问题变得越来越重要。
参考文献：
[1]KUMA T， YAMAMOTO T. Crispr/cas9： the leading edge of genome editing technology[J]. Targeted Genome Editing Using Site-specific Nucleases， 2015， 7： 25-41.
[2]SAKUMA T， YAMAMOTO T. Current overview of TALEN construction systems. Methods In Molecular Biology， 2017， 1630： 25-36.
[3]NAKADE S， YAMAMOTO T， SAKUMA T. Cas9， Cpf1 and C2c1/2/3-what’s next [J].Bioengineered， 2017， 8： 265-273.
[4]NAKADE S， MOCHIDA K， KUNII A， et al. Biased genome editing using the local accumulation of DSB repair molecules system[J]. Nature Communications ， 2018， 9： 3270-3280.
[5]KIM S I， MATSUMOTO T， KAGAWA H， et al. Microhomology-assisted scarless genome editing in human iPSCs[J]. Nature Communications ， 2018， 9： 939-952. [6] KOMOR A C， KIM Y B， PACKER M S， et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage[J]. Nature， 2016， 533： 420-424.
[7]SHIMATANI Z， KASHOJIYA S， TAKAYAMA M， et al. Targeted base editing in rice and tomato using a CRISPR-Cas9 cytidine deaminase fusion[J]. Nature Biotechnology， 2017， 35： 441-443.
[8]WANG T， WEI J J， SABATINI D M， et al. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system[J]. Science， 2014， 343： 80-84.
[9]CHEN S， SANJANA N E， ZHENG K， et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis[J]. Cell， 2015， 160： 1246-1260.
[10]HON C C， RamilowskiAMILOWSKI J A， HARSHBARGER J， et al. An atlas of human long non-coding RNAs with accurate 5′ ends[J]. Nature， 2017， 543： 199-204.
[11]MCKENNA A， FINDLY G M， GAGNON J A， et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing[J]. Science， 2016l， 353： 1-17.
[12]TAKASHINA T， KOYAMA T， NOHARA S， et al. Identification of a cell-penetrating peptide applicable to a protein-based transcription activator-like effector expression system for cell engineering[J]. Biomaterials， 2018， 173： 11‐21.
[13]GOOTENBERG J S， ABUDAYYEH O O， LEE J W， et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2[J]. Science， 2017， 356： 438-442.
[14]MYERS S A， WRIGHT J， PECKNER R， et al. Discovery of proteins associated with a predefined genomic locus via dCas9-APEX- mediated proximity labeling[J]. Nature Methods， 2018， 15： 437-439.
[15]FUJITA T， FUJII H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation （enChIP） using CRISPR[J]. Biobiochemica and Physalic Research Communication， 2013， 439： 132-136.
作者簡介：周瑜，女，汉，1994年3月生，重庆人，硕士研究生，学生（西南民族大学，青藏高原研究院，遗传学专业，2018级），研究方向：分子遗传学与基因工程。
西南民族大学，四川 成都 610041
关键词：基础编辑;癌症科学;CRISPR-Cas9;基因组编辑;转录组编辑;
【中图分类号】R246.5 【文献标识码】A 【文章编号】2026-5328（2021）05-124-03
Abstract：Genome editing includes various edits of the genome， such as short insertions and deletions， substitutions and chromosomal rearrangements including inversions， duplications and translocations. These variations are based on single or multiple DNA double-strand break （DSB）-triggered in cellulo repair machineries. In addition to these “conventional” genome editing strategies， tools enabling customized， site-specific recognition of particular nucleic acid sequences have been coming into wider use： for example， single base editing without DSB introduction， epigenome editing with recruitment of epigenetic modifiers， transcriptome engineering using RNA editing systems， and in vitro detection of specific DNA and RNA sequences. In this review， we provide a quick overview of the current state of genome editing and related technologies that multilaterally contribute to cancer science.
Key words： base editing; cancer science; CRISPR-Cas9; genome editing; transcriptome editing;
1.介紹
基因的定义是遗传信息的一个单位，这是一个相当概念化的术语。在活细胞中，有编码基因和非编码基因，分别作为蛋白质和RNA发挥作用。基因可以在体外用于各种目的，包括无细胞转录和翻译的创造，以及遗传疾病、癌症和传染病的诊断。
基因组编辑工具可以设计具有可定制DNA结合和裂解特性的基因，这些特性适用于活细胞和有机体。它们对于基因组DNA的序列改变无疑是有用的，可以进行简单的基因敲除和敲入，也可以进行更为复杂的编辑。然而，考虑到上述基因的众多特点，基因的编辑技术也变得多样化。事实上，在过去的几年中，各种方法和技术得到了迅速发展、改进，并以各种方式得到了应用。
2.基因组编辑的衍生技术
由于基因组编辑领域技术的飞速发展，使得该领域的研究很难保持与时俱进。到目前为止，已有课题组发表了许多关于基因组编辑的评论，其中包含了每次发表时可以获得的最新信息。例如，大纲的这项技术包括历史背景综述了2014年，集中审查CRISPR-Cas9于2015年出版[1]，以及转录激活子样效应子（TALE）核酸酶（TALEN）系统的全面概述[2]。在这些回顾中，介绍了各项技术发展成就包括高度活跃的TALE/TALEN变体，名为Platinum TALE/TALEN。
之前报道了一些重要的创新，如具有更广泛PAM特异性的xCas9， HypaCas9和桥接核酸结合CRISPR RNA[3]用于超准确的DNA识别，以及Cas9-HE用于高效的同源依赖修复。此外，在2018年开发的DSB修复分子（LoAD）局部积累系统，该系统支持修复通路偏向的基因组编辑[4]。在转录激活子样效应核酸酶（TALEN）系统中，传统的TALEN包含恒定重复，没有非重复可变双残基（非RVD）变异而该课题组改良的TALEN包含非RVD变异的可变重复，导致更高的核酸酶活性。
3. 技术理论
3.1 单碱基对编辑
碱基编辑是一种较新的基因组编辑方法，它使用CRISPR系统的组件和其他酶直接将点突变安装到细胞DNA或RNA中，而不会造成双链DNA断裂。
单碱基对编辑是一种用于疾病建模和校正的基因组序列的精细而重要的修饰方法。各种依赖于DBS介导的传统基因组编辑的复杂策略已经被报道并且在这一领域正在不断发展。最近的一个例子是微同源介导的末端连接（MMEJ）依赖策略，称为MhAX[5]，实现了一种MMEJ依赖的基因编辑策略，称为音高系统，在盒式磁带切除。
单碱基对编辑的基本概念是胞嘧啶脱氨酶介导胞嘧啶转化为尿嘧啶，然后是胸腺嘧啶。胞苷脱氨酶，如APOBEC1，与dCas9或Cas9n （Cas9 nickase）结合，靶向特定的基因组位点。单碱基对编辑系统的适用性最初在酵母和哺乳动物细胞中被证实[6]，然后是各种生物体，包括植物，老鼠，海胆和细菌[7]。 3.2 全基因組筛查
基因组编辑核酸酶通常用于逆向遗传学，但《科学与自然生物技术》上发表的三篇里程碑式论文开创了CRISPR介导的正向遗传学的新时代[8]，慢病毒RNAi筛选系统被CRISPR-Cas9所取代。将全基因组慢病毒单指南RNA（sgRNA）文库汇集并感染培养细胞，进行预期的抗肿瘤药物耐药性，并通过下一代测序分析富集的sgRNA。近年来，基于CRISPR/ Cas9的联合筛选方法迅速改变了功能基因组学领域。突变体的容易产生、较低的靶外效应和Cas9蛋白的工程通用性通常使全基因组CRISPR/Cas9为基础的筛选优于大规模的RNAi筛选。
在癌症科学的背景下，以下强调使用全基因组筛选的几个关键研究。第一项研究是肿瘤生长和转移相关基因的体外筛选 [9]，分被引入非转移性小鼠癌细胞，然后移植到成年小鼠中，筛选肿瘤生长和转移相关突变。第二项研究是一系列报道长非编码RNA（lncRNA）筛选的研究。最近的一项研究发现了lncRNAs的多样性，并推测数千个lncRNAs与人类疾病有关[10]。
汇集的全基因组筛选虽然有助于推断生物功能，但不能根据其转录状态提供关于细胞状态的详细信息。在传统的CRISPR/Cas9合用屏幕上，读出的只是细胞池中包含的大量gRNA序列，无法有效地提供所需的分辨率来进行综合表型。
3.3 DNA条码和记录
正如已经介绍过的那样，具有反向和正向遗传学的基因组编辑显著促进了癌症的特征描述;然而，从临床肿瘤学的观点来看，癌症进化所产生的大量突变使事情变得极其复杂。们将获得一个强大的武器来应对这一巨大的挑战，它们可以大致分为两种策略：DNA条码和记录。
格式塔法将条形码整合到能够引入多种突变模式的基因组中，实现了斑马鱼的整个有机体谱系追踪[11]。通过测序分析了条形码中独立引入和进化的突变模式，从而实现了谱系追踪。
3.4 转录控制和表观基因组编辑
虽然每一种方法都是可变的，但是上面介绍的所有技术都伴随着DNA序列的改变。相反，控制基因表达或操纵表观遗传修饰也可以在不改变DNA序列的情况下调节表型。
首先，之前报道的整合的多倍腺病毒CRISPRi载体，同时携带融合了转录抑制域、KRAB和多个sgRNA的dCas9，在培养细胞和体内有效地显示了抗肿瘤作用。其次，以TALE为基础的转录因子和表观遗传修饰因子也是该领域很有前途的工具。相关研究表明，只要加入一种与转录激活域和细胞穿透肽融合的重组铂层蛋白，就可以实现诱导多能干细胞的重编程[12]。
3.5 其他新兴技术：RNA靶向和编辑、基于CRISPR的诊断和邻近标记
在转录组编辑和体外诊断方面，RNA引导的RNA靶向酶Cas13是一个值得关注的系统。据报道，Cas13可用于基因敲除和靶向RNA结合，用于转录的活细胞跟踪。通过使用其他Cas蛋白质如CsrX显示了类似的应用。Cas13进一步被用于病毒核酸的诊断和无细胞DNA的癌症检测。最初的系统被称为SHERLOCK，它能够从数量有限的靶DNA和RNA中进行低成本、高灵敏度和鲁棒的检测[13]。
GloPro和C-BERST均可实现dCas9-APEX介导的靶向基因组DNA区域邻近标记，用于位点特异性蛋白组学[14]。之前的系统称为工程染色质免疫沉淀（enChIP），其基础是标记的dCas9介导的沉淀[15]; 然而，这些新系统在生物素-苯酚和H2O2存在的情况下，仅通过sgRNA表达dCas9-APEX，很容易对近端蛋白进行生物酰化。这些技术还应该有助于癌症相关基因启动子/增强子区域的蛋白质组学分析。
4.结论
我们相信，DSB介导的标准基因组编辑是一项改变世界的技术，毫无疑问，它极大地改变了包括癌症科学在内的生命科学研究。然而，除此之外，许多新技术目前正在等待机会来创建一个范式转移（或者可能是多个范式转移）。为了充分利用这些新兴技术，我们必须密切关注它们。
在另一方面，最近的调查警告了在应用CRISPR-Cas9时发生肿瘤的风险、意外的异质性和可变的目标编辑结果。随着基因组编辑应用的急剧增加，安全问题变得越来越重要。
参考文献：
[1]KUMA T， YAMAMOTO T. Crispr/cas9： the leading edge of genome editing technology[J]. Targeted Genome Editing Using Site-specific Nucleases， 2015， 7： 25-41.
[2]SAKUMA T， YAMAMOTO T. Current overview of TALEN construction systems. Methods In Molecular Biology， 2017， 1630： 25-36.
[3]NAKADE S， YAMAMOTO T， SAKUMA T. Cas9， Cpf1 and C2c1/2/3-what’s next [J].Bioengineered， 2017， 8： 265-273.
[4]NAKADE S， MOCHIDA K， KUNII A， et al. Biased genome editing using the local accumulation of DSB repair molecules system[J]. Nature Communications ， 2018， 9： 3270-3280.
[5]KIM S I， MATSUMOTO T， KAGAWA H， et al. Microhomology-assisted scarless genome editing in human iPSCs[J]. Nature Communications ， 2018， 9： 939-952. [6] KOMOR A C， KIM Y B， PACKER M S， et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage[J]. Nature， 2016， 533： 420-424.
[7]SHIMATANI Z， KASHOJIYA S， TAKAYAMA M， et al. Targeted base editing in rice and tomato using a CRISPR-Cas9 cytidine deaminase fusion[J]. Nature Biotechnology， 2017， 35： 441-443.
[8]WANG T， WEI J J， SABATINI D M， et al. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system[J]. Science， 2014， 343： 80-84.
[9]CHEN S， SANJANA N E， ZHENG K， et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis[J]. Cell， 2015， 160： 1246-1260.
[10]HON C C， RamilowskiAMILOWSKI J A， HARSHBARGER J， et al. An atlas of human long non-coding RNAs with accurate 5′ ends[J]. Nature， 2017， 543： 199-204.
[11]MCKENNA A， FINDLY G M， GAGNON J A， et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing[J]. Science， 2016l， 353： 1-17.
[12]TAKASHINA T， KOYAMA T， NOHARA S， et al. Identification of a cell-penetrating peptide applicable to a protein-based transcription activator-like effector expression system for cell engineering[J]. Biomaterials， 2018， 173： 11‐21.
[13]GOOTENBERG J S， ABUDAYYEH O O， LEE J W， et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2[J]. Science， 2017， 356： 438-442.
[14]MYERS S A， WRIGHT J， PECKNER R， et al. Discovery of proteins associated with a predefined genomic locus via dCas9-APEX- mediated proximity labeling[J]. Nature Methods， 2018， 15： 437-439.
[15]FUJITA T， FUJII H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation （enChIP） using CRISPR[J]. Biobiochemica and Physalic Research Communication， 2013， 439： 132-136.
作者簡介：周瑜，女，汉，1994年3月生，重庆人，硕士研究生，学生（西南民族大学，青藏高原研究院，遗传学专业，2018级），研究方向：分子遗传学与基因工程。
西南民族大学，四川 成都 610041