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摘要：目的 观察耳聋左慈丸对老年肾虚耳聋小鼠耳蜗组织水通道蛋白4（AQP4）表达的影响，探讨其作用机制。方法 除正常组对照组外，其他小鼠采用腹腔注射氢化可的松方法复制肾虚小鼠模型，造模成功后，随机分为模型组、中药组，每组16只。中药组予耳聋左慈丸水煎液灌胃，模型组和正常对照组予生理盐水灌胃，共22 d。运用耳蜗铺片技术观察小鼠耳蜗内、外毛细胞与支持细胞的形态学变化；采用免疫组化法、Western blot检测耳蜗组织AQP4蛋白表达。结果 与正常对照组比较，模型组小鼠耳蜗内、外毛细胞和支持细胞缺失或散乱；与模型组比较，中药组耳蜗内、外毛细胞和支持细胞排列较整齐，边界尚清楚；小鼠耳蜗组织AQP4蛋白表达结果显示，与模型组比较，中药组AQP4蛋白表达增强（P<0.01），中药组与正常对照组AQP4蛋白表达无显著差异。结论 耳聋左慈丸可能通过上调耳蜗组织AQP4蛋白表达，达到治疗肾虚小鼠耳聋的作用。
关键词：耳聋左慈丸；肾虚耳聋；耳蜗；水通道蛋白4；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.05.019
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）05-0069-03
Abstract：Objective To investigate the effects of Erlong Zuoci Pills on AQP4 expression in cochlear tissue of mice with elderly kidney deficiency deafness；To discuss the action mechanism. Methods Intraperitoneal injection of hydrocortisone method was used to duplicate mice models with kidney deficiency except the normal control group. After the models were established， mice were divided into model group and TCM group， 16 mice in each group. TCM group was gavaged by Erlong Zuoci Pills， model group and normal control group were gavaged by normal saline for 22 d. Cochlear stretched preparation technology was used to observe morphological changes in cochlear inner and outer hair cells， and supporting cells. Immunohistochemistry and Western bolt were used to detect protein expression of AQP4. Results Compared with normal control group， mice in model group missed inner and outer hair cells and supporting cells of the cochlea. Compared with model group， arrangement of cochlear inner and outer hair cells and supporting cells was neat and boundary was clear in TCM group. Compared with model group， protein expression of AQP4 in cochlear tissues in TCM group increased （P<0.01）. There was no difference between TCM group and normal control group. Conclusion Erlong Zuoci Pills have significant therapeutic effect for elderly kidney deficiency deafness， and the treatment is related to the upregulation of protein expression of AQP4 in cochlear tissues.
Key words：Erlong Zuoci Pills；kidney deficiency deafness；cochlea；AQP4；mice
中医认为，耳司听觉、主平衡，肾为先天之本、藏精之脏，开窍于耳，耳的听觉灵敏依靠肾精的充沛，髓海的充足。肾气亏虚是老年性耳聋发病的本质所在。耳聋左慈丸是治疗老年肾虚耳聋的经典方剂，用于临床数十载，其疗效得到广泛认可 [1-2]。水通道蛋白（aquaporin，AQP）主要作用在于参与水分子的跨膜转运，且已被证实在哺乳动物内耳有多种亚型的分布，而在内外淋巴循环及听力平衡中的作用至关重要，所以推测AQP对听力功能可能起着重要的作用[3]。本研究通过建立老年肾虚耳聋模型，观察耳蜗组织AQP4蛋白表达的变化，并探讨耳聋左慈丸的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物
清洁级昆明小鼠66只，11～12月龄，雌雄不拘，体质量（20±5）g，辽宁中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（辽）2012-0018。自由饮水、摄取标准颗粒饲料，室内温度22 ℃，相对湿度45%。 1.2 药物
耳聋左慈丸汤剂（熟地黄24 g，山萸肉12 g，山药12 g，茯苓9 g，泽泻9 g，牡丹皮9 g，柴胡3 g，磁石3 g），饮片购于辽宁中医药大学附属医院。氢化可的松注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批号20130522。
1.3 主要试剂与仪器
SABC试剂盒（抗兔）、DAB显色液（北京鼎国试剂有限公司），亲和纯化兔抗鼠AQP4多克隆抗体（Proteintech）。动物颅骨钻（成都泰盟科技有限公司），FSH-Ⅱ型高速电动匀浆器（江苏金坛市环宇科学技术仪器厂），PoMini-Protein Ⅲ垂直板电泳装置（美国BIO-RAD），解剖显微镜（日本OLYMPUS 322598）， werPac200电泳仪（美国BIO-RAD）。
1.4 分组与造模
随机抽取50只小鼠，参照文献[4]方法造模。小鼠每日按0.5 mg/只剂量腹腔注射氢化可的松，共9 d。之后进行听力测试：注射10%水合氯醛麻醉，置于隔声屏蔽室内，应用脑干诱发电位仪（丹麦）进行检测。每只小鼠分别测试双耳ABR反应阈。每耳测3次，以至少一耳ABR阈值≥15 dB为耳聋模型制备成功。小鼠出现体毛枯槁无光泽或稀疏脱落，四肢无力、活动少，听力减退（至少一耳ABR阈值≥15 dB）为肾虚耳聋模型制备成功。成功获得老年肾虚耳聋小鼠32只。按随机数字表法将肾虚耳聋小鼠分为模型组和中药组各16只。另16只小鼠作为正常对照组。
1.5 给药
耳聋左慈丸汤剂按照中药水煎液制备，浓缩至0.3 g/mL[5]，按照小鼠的体质量换算得出小鼠的给药量为0.5 mL/只，每日灌胃1次，共22 d。模型组和正常对照组每日给予0.5 mL/只生理盐水灌胃，共22 d。
1.6 指标观察与测定
1.6.1 耳蜗基底膜铺片及形态学观察 采用基底膜硬铺片法[6]。将小鼠断颈处死，取出双侧听泡，行耳蜗铺片，在解剖显微镜下去除镫骨，用细钢针挑破蜗顶骨壳和蜗窗及前庭窗膜，从蜗尖灌注4%甲醛溶液并固定于该溶液中24 h（4 ℃）。固定的耳蜗经0.1 mol/L PBS洗涤，脱钙1周。在20倍解剖显微镜下剥离耳蜗，取全层基底膜于生物显微镜下观察，摄片。
1.6.2 免疫组化法检测小鼠耳蜗组织水通道蛋白4的表达 采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术，即SABC法。兔抗鼠AQP4一抗（1∶100）稀释后滴加，4 ℃冰箱过夜，切片PBS液冲洗3次后滴加二抗，室温放置30 min。经PBS液冲洗3次后滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温放置30 min。DAB显色，苏木素复染，反向梯度脱水，每张切片滴中性树胶1滴，盖玻片封片。在生物显微镜下观察，以胞膜或胞浆有棕黄色染色者为阳性细胞。应用BI2000医学图像分析系统，对采集的图像测定阳性反应物的灰度，每只动物随机取5～6张切片，且各组所选部位相同。
1.6.3 Western blot检测小鼠耳蜗组织水通道蛋白4的表达 将耳蜗组织取出后放入EP管中，加入pH 7.5裂解液，将样品剪碎后匀浆，12 000 r/min离心15 min，取上清液即为总蛋白。兔抗鼠AQP4一抗（1∶1000），山羊抗兔二抗（1∶10 000）抗体稀释液稀释后， O-dianidine、β-naphthyl acid phosphate显色，扫描仪扫描NC膜，分析结果。
1.7 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 耳聋左慈丸对小鼠耳蜗基底膜形态学的影响
正常对照组耳蜗内、外毛细胞与支持细胞基本无缺失，排列整齐。模型组耳蜗支持细胞排列混乱，甚至缺失或脱如，外毛细胞缺失严重，波及中回和顶回，在耳蜗底回和中回的内毛细胞亦有缺失，仅见零星残留，残余的内毛细胞静纤毛丛散乱、变短融合、断根。中药组耳蜗内、外毛细胞和支持细胞排列较整齐，外毛细胞缺少并不严重，边界尚清楚。中药组与模型组差异明显。见图1。
2.2 耳聋左慈丸对小鼠耳蜗组织水通道蛋白4表达的影响
免疫组化检测显示，AQP4免疫反应物呈棕黄色，其反应部位位于螺旋神经节细胞及基底膜外侧Cortis'器的Hensen细胞和Claudius细胞等处，染色强度中药组较模型组明显变深，见图2。与模型组比较，中药组AQP4蛋白表达水平上调（P<0.01），见表1。
Western blot检测显示，中药组与正常对照组耳蜗组织AQP4蛋白表达无明显差异，中药组耳蜗组织AQP4蛋白表达较模型组上调（P<0.01），见图3、表2。
3 讨论
由于年龄增长使听觉器官衰老、退变而出现的双耳对称、缓慢进行性的感音神经性听力减退，定义为老年性耳聋。近年来研究发现，11～12月龄小鼠耳蜗底回和中回外毛细胞几乎完全丧失，内毛细胞显著缺失[7]。耳蜗螺旋神经节细胞退变，血管纹老化引起能量转导减少，呈隐性进行性退变是老年性耳聋的关键。本实验中，模型组耳蜗毛细胞与支持细胞排列紊乱，甚至变短或融合，从而与该研究结果相符。1991年，Agre[8]在红细胞克隆了AQP1，证明了该蛋白具有很强的水通透性，从此AQP成为人们研究的热点。鉴于AQP对水分子的高度通透性和内淋巴容积的稳定及内耳内环境的稳定对听力功能的重要作用，人们开始研究AQP与内耳疾病的关系。黄氏等[9]研究发现，小鼠内耳中有多种AQP亚型的存在，而且其分布区域没有重叠性，在内耳环境的调节中起着协调平衡作用，而其中AQP4在小鼠内耳中分布最广泛，而AQP4基因敲除的小鼠出现明显的听力受损（神经性耳聋除外）[10]。听力损失的严重程度可能与耳蜗细胞中AQP4的表达有关。有研究表明，随着年龄的增长，听力损失愈发严重，则AQP4表达呈现下降趋势，而中脑中AQP4 mRNA表达则出现先降后升的波动性表达[11]。 现代医学对肾与耳在研究耳聋方面的资料尚少。本研究采用耳蜗铺片技术更加清楚直观地看到模型组与中药组耳蜗毛细胞与支持细胞的变化。免疫组化和Western blot检测结果表明，模型组小鼠AQP4蛋白表达降低，中药组AQP4蛋白表达增强，提示耳聋左慈丸治疗肾虚耳聋可能是通过上调耳蜗组织AQP4蛋白表达而发挥治疗作用。但肾虚通过何种途径或何种通路影响耳蜗组织AQP4的表达，还有待进一步探讨。
参考文献：
[1] 芮其根.耳聋左慈丸加减治疗肾虚性耳鸣耳聋86例[J].中医药临床杂志，2007，19（3）：280-281.
[2] 路军章，赵红，李为.民耳聋左慈丸联合松龄血脉康治疗耳鸣的临床观察[J].中华耳科学杂志2009，7（3）：204-207.
[3] Andreas Eckhard， Corinna Gleiser. Water channel proteins in the inner ear and their link to hearing impairment and deafness[J]. Molecular Aspects Medicine，2012，23（5）：612-637.
[4] 徐亚平，顾健，刘海斌，等.内耳形态学和生理指标对缺铁性肾虚耳聋大鼠模型的评价作用[J].中国实验动物学报，2012，20（3）：29-32.
[5] 宋海燕，董杨，王静.耳聋左慈丸药对拆方拮抗庆大霉素所致耳蜗毛细胞损伤的研究[J].上海中医药杂志，2013，47（8）：70-73.
[6] 徐飞，丛品，王枫.“肾虚”对老龄豚鼠听觉功能影响的实验研[J].中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，2008，16（2）：81-85.
[7] Mingqian Huang， Albena Kantardzhieva， Deborah Scheffer. Hair cell overexpression of islet 1 reduces age-relatedand noise- induced hearing loss[J]. The Journal of Neuroscience，2013， 33（38）：15086-15094.
[8] Leiteh V， Agre P， King LS. Altered ubiquitination and stability of aquaporin-1 in hypertonic stress[J]. Proc. Natl Acad. Sci USA， 2001，98（5）：2894-2898.
[9] 黄德亮.小鼠内耳水通道蛋白的定位及其意义[J].中华耳鼻咽喉科杂志，2001，36（1）：7-9.
[10] Jiang Li， AS Verkman. Impaired hearing in mice lacking Aquaporin-4 water channels[J]. The Jouranal of Biological Chemistry，2001，276（33）：31233-31237.
[11] Nathan Christensen. Mary D'Souza Age-related hearing loss：Aquaporin 4 gene expression changes[J]. NIH Public Access Author Manuscript，2009，2（9）：27-34.
（收稿日期：2014-11-09；编辑：华强）
关键词：耳聋左慈丸；肾虚耳聋；耳蜗；水通道蛋白4；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.05.019
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）05-0069-03
Abstract：Objective To investigate the effects of Erlong Zuoci Pills on AQP4 expression in cochlear tissue of mice with elderly kidney deficiency deafness；To discuss the action mechanism. Methods Intraperitoneal injection of hydrocortisone method was used to duplicate mice models with kidney deficiency except the normal control group. After the models were established， mice were divided into model group and TCM group， 16 mice in each group. TCM group was gavaged by Erlong Zuoci Pills， model group and normal control group were gavaged by normal saline for 22 d. Cochlear stretched preparation technology was used to observe morphological changes in cochlear inner and outer hair cells， and supporting cells. Immunohistochemistry and Western bolt were used to detect protein expression of AQP4. Results Compared with normal control group， mice in model group missed inner and outer hair cells and supporting cells of the cochlea. Compared with model group， arrangement of cochlear inner and outer hair cells and supporting cells was neat and boundary was clear in TCM group. Compared with model group， protein expression of AQP4 in cochlear tissues in TCM group increased （P<0.01）. There was no difference between TCM group and normal control group. Conclusion Erlong Zuoci Pills have significant therapeutic effect for elderly kidney deficiency deafness， and the treatment is related to the upregulation of protein expression of AQP4 in cochlear tissues.
Key words：Erlong Zuoci Pills；kidney deficiency deafness；cochlea；AQP4；mice
中医认为，耳司听觉、主平衡，肾为先天之本、藏精之脏，开窍于耳，耳的听觉灵敏依靠肾精的充沛，髓海的充足。肾气亏虚是老年性耳聋发病的本质所在。耳聋左慈丸是治疗老年肾虚耳聋的经典方剂，用于临床数十载，其疗效得到广泛认可 [1-2]。水通道蛋白（aquaporin，AQP）主要作用在于参与水分子的跨膜转运，且已被证实在哺乳动物内耳有多种亚型的分布，而在内外淋巴循环及听力平衡中的作用至关重要，所以推测AQP对听力功能可能起着重要的作用[3]。本研究通过建立老年肾虚耳聋模型，观察耳蜗组织AQP4蛋白表达的变化，并探讨耳聋左慈丸的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物
清洁级昆明小鼠66只，11～12月龄，雌雄不拘，体质量（20±5）g，辽宁中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（辽）2012-0018。自由饮水、摄取标准颗粒饲料，室内温度22 ℃，相对湿度45%。 1.2 药物
耳聋左慈丸汤剂（熟地黄24 g，山萸肉12 g，山药12 g，茯苓9 g，泽泻9 g，牡丹皮9 g，柴胡3 g，磁石3 g），饮片购于辽宁中医药大学附属医院。氢化可的松注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批号20130522。
1.3 主要试剂与仪器
SABC试剂盒（抗兔）、DAB显色液（北京鼎国试剂有限公司），亲和纯化兔抗鼠AQP4多克隆抗体（Proteintech）。动物颅骨钻（成都泰盟科技有限公司），FSH-Ⅱ型高速电动匀浆器（江苏金坛市环宇科学技术仪器厂），PoMini-Protein Ⅲ垂直板电泳装置（美国BIO-RAD），解剖显微镜（日本OLYMPUS 322598）， werPac200电泳仪（美国BIO-RAD）。
1.4 分组与造模
随机抽取50只小鼠，参照文献[4]方法造模。小鼠每日按0.5 mg/只剂量腹腔注射氢化可的松，共9 d。之后进行听力测试：注射10%水合氯醛麻醉，置于隔声屏蔽室内，应用脑干诱发电位仪（丹麦）进行检测。每只小鼠分别测试双耳ABR反应阈。每耳测3次，以至少一耳ABR阈值≥15 dB为耳聋模型制备成功。小鼠出现体毛枯槁无光泽或稀疏脱落，四肢无力、活动少，听力减退（至少一耳ABR阈值≥15 dB）为肾虚耳聋模型制备成功。成功获得老年肾虚耳聋小鼠32只。按随机数字表法将肾虚耳聋小鼠分为模型组和中药组各16只。另16只小鼠作为正常对照组。
1.5 给药
耳聋左慈丸汤剂按照中药水煎液制备，浓缩至0.3 g/mL[5]，按照小鼠的体质量换算得出小鼠的给药量为0.5 mL/只，每日灌胃1次，共22 d。模型组和正常对照组每日给予0.5 mL/只生理盐水灌胃，共22 d。
1.6 指标观察与测定
1.6.1 耳蜗基底膜铺片及形态学观察 采用基底膜硬铺片法[6]。将小鼠断颈处死，取出双侧听泡，行耳蜗铺片，在解剖显微镜下去除镫骨，用细钢针挑破蜗顶骨壳和蜗窗及前庭窗膜，从蜗尖灌注4%甲醛溶液并固定于该溶液中24 h（4 ℃）。固定的耳蜗经0.1 mol/L PBS洗涤，脱钙1周。在20倍解剖显微镜下剥离耳蜗，取全层基底膜于生物显微镜下观察，摄片。
1.6.2 免疫组化法检测小鼠耳蜗组织水通道蛋白4的表达 采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术，即SABC法。兔抗鼠AQP4一抗（1∶100）稀释后滴加，4 ℃冰箱过夜，切片PBS液冲洗3次后滴加二抗，室温放置30 min。经PBS液冲洗3次后滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温放置30 min。DAB显色，苏木素复染，反向梯度脱水，每张切片滴中性树胶1滴，盖玻片封片。在生物显微镜下观察，以胞膜或胞浆有棕黄色染色者为阳性细胞。应用BI2000医学图像分析系统，对采集的图像测定阳性反应物的灰度，每只动物随机取5～6张切片，且各组所选部位相同。
1.6.3 Western blot检测小鼠耳蜗组织水通道蛋白4的表达 将耳蜗组织取出后放入EP管中，加入pH 7.5裂解液，将样品剪碎后匀浆，12 000 r/min离心15 min，取上清液即为总蛋白。兔抗鼠AQP4一抗（1∶1000），山羊抗兔二抗（1∶10 000）抗体稀释液稀释后， O-dianidine、β-naphthyl acid phosphate显色，扫描仪扫描NC膜，分析结果。
1.7 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 耳聋左慈丸对小鼠耳蜗基底膜形态学的影响
正常对照组耳蜗内、外毛细胞与支持细胞基本无缺失，排列整齐。模型组耳蜗支持细胞排列混乱，甚至缺失或脱如，外毛细胞缺失严重，波及中回和顶回，在耳蜗底回和中回的内毛细胞亦有缺失，仅见零星残留，残余的内毛细胞静纤毛丛散乱、变短融合、断根。中药组耳蜗内、外毛细胞和支持细胞排列较整齐，外毛细胞缺少并不严重，边界尚清楚。中药组与模型组差异明显。见图1。
2.2 耳聋左慈丸对小鼠耳蜗组织水通道蛋白4表达的影响
免疫组化检测显示，AQP4免疫反应物呈棕黄色，其反应部位位于螺旋神经节细胞及基底膜外侧Cortis'器的Hensen细胞和Claudius细胞等处，染色强度中药组较模型组明显变深，见图2。与模型组比较，中药组AQP4蛋白表达水平上调（P<0.01），见表1。
Western blot检测显示，中药组与正常对照组耳蜗组织AQP4蛋白表达无明显差异，中药组耳蜗组织AQP4蛋白表达较模型组上调（P<0.01），见图3、表2。
3 讨论
由于年龄增长使听觉器官衰老、退变而出现的双耳对称、缓慢进行性的感音神经性听力减退，定义为老年性耳聋。近年来研究发现，11～12月龄小鼠耳蜗底回和中回外毛细胞几乎完全丧失，内毛细胞显著缺失[7]。耳蜗螺旋神经节细胞退变，血管纹老化引起能量转导减少，呈隐性进行性退变是老年性耳聋的关键。本实验中，模型组耳蜗毛细胞与支持细胞排列紊乱，甚至变短或融合，从而与该研究结果相符。1991年，Agre[8]在红细胞克隆了AQP1，证明了该蛋白具有很强的水通透性，从此AQP成为人们研究的热点。鉴于AQP对水分子的高度通透性和内淋巴容积的稳定及内耳内环境的稳定对听力功能的重要作用，人们开始研究AQP与内耳疾病的关系。黄氏等[9]研究发现，小鼠内耳中有多种AQP亚型的存在，而且其分布区域没有重叠性，在内耳环境的调节中起着协调平衡作用，而其中AQP4在小鼠内耳中分布最广泛，而AQP4基因敲除的小鼠出现明显的听力受损（神经性耳聋除外）[10]。听力损失的严重程度可能与耳蜗细胞中AQP4的表达有关。有研究表明，随着年龄的增长，听力损失愈发严重，则AQP4表达呈现下降趋势，而中脑中AQP4 mRNA表达则出现先降后升的波动性表达[11]。 现代医学对肾与耳在研究耳聋方面的资料尚少。本研究采用耳蜗铺片技术更加清楚直观地看到模型组与中药组耳蜗毛细胞与支持细胞的变化。免疫组化和Western blot检测结果表明，模型组小鼠AQP4蛋白表达降低，中药组AQP4蛋白表达增强，提示耳聋左慈丸治疗肾虚耳聋可能是通过上调耳蜗组织AQP4蛋白表达而发挥治疗作用。但肾虚通过何种途径或何种通路影响耳蜗组织AQP4的表达，还有待进一步探讨。
参考文献：
[1] 芮其根.耳聋左慈丸加减治疗肾虚性耳鸣耳聋86例[J].中医药临床杂志，2007，19（3）：280-281.
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[3] Andreas Eckhard， Corinna Gleiser. Water channel proteins in the inner ear and their link to hearing impairment and deafness[J]. Molecular Aspects Medicine，2012，23（5）：612-637.
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[5] 宋海燕，董杨，王静.耳聋左慈丸药对拆方拮抗庆大霉素所致耳蜗毛细胞损伤的研究[J].上海中医药杂志，2013，47（8）：70-73.
[6] 徐飞，丛品，王枫.“肾虚”对老龄豚鼠听觉功能影响的实验研[J].中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，2008，16（2）：81-85.
[7] Mingqian Huang， Albena Kantardzhieva， Deborah Scheffer. Hair cell overexpression of islet 1 reduces age-relatedand noise- induced hearing loss[J]. The Journal of Neuroscience，2013， 33（38）：15086-15094.
[8] Leiteh V， Agre P， King LS. Altered ubiquitination and stability of aquaporin-1 in hypertonic stress[J]. Proc. Natl Acad. Sci USA， 2001，98（5）：2894-2898.
[9] 黄德亮.小鼠内耳水通道蛋白的定位及其意义[J].中华耳鼻咽喉科杂志，2001，36（1）：7-9.
[10] Jiang Li， AS Verkman. Impaired hearing in mice lacking Aquaporin-4 water channels[J]. The Jouranal of Biological Chemistry，2001，276（33）：31233-31237.
[11] Nathan Christensen. Mary D'Souza Age-related hearing loss：Aquaporin 4 gene expression changes[J]. NIH Public Access Author Manuscript，2009，2（9）：27-34.
（收稿日期：2014-11-09；编辑：华强）