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摘 要：低浓度苯、甲苯、二甲苯等有机污染物被广泛用于油漆喷涂以及印染的工业过程，具有废气量大，浓度低等特点，用物理，化学方法难处理，而微生物法处理是一种较为经济，有效且无二次污染的处理方法，通过实验驯化，筛选出能够以甲苯或二甲苯为唯一碳源的菌株，对其进行纯化培养，富集培养，对最后的优势菌种进行简单的鉴定。
关键词：低浓度甲苯废气;菌种驯化筛选;菌种鉴定
1实验基本流程
2实验方法
2.1培养基的制备
2.1.1培养基类型
牛肉膏蛋白胨固态培养基，液态培养基
2.1.2实验器皿和材料
高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、无菌操作台、脱脂棉、酒精灯、培养皿、试管、锥形瓶、玻璃棒、天平、药匙、烧杯、加热板、量筒、pH试纸等。
2.1.3配制过程
依据附录一的配方配制牛肉膏蛋白胨固态培养基
2.2培养基的灭菌
实验一般都要求实验材料进行无杂菌的纯培养，所以实验中所用的器材都要经过包装灭菌。
2.2.1干热灭菌法
将用锡箔纸包装好的培养皿、烧杯、玻璃棒等玻璃器皿放入电热干燥箱，将温度调至165°C后维持2h，灭菌好的器皿应保存完好，否则易染菌。
2.2.2高压蒸汽灭菌法
将完全溶解的培养基倒入锥形瓶，每个锥形瓶倒入150ml到200mL的培养基，分装好后，将锥形瓶口塞上脱脂棉，用锡箔纸密封。将物品放在高压蒸汽灭菌锅0.1MPa，121.5℃保持20～30分钟灭菌。
2.3培养基平板的制备
将高压蒸汽灭菌的培养基在室温下冷却到50℃左右，在无菌操作台上，将培养基倒入培养皿中，等其冷却凝固，制成平板。
3菌种的筛选和驯化
3.1菌种的培养
3.1.1初步培养
为了得到有降解甲苯和二甲苯能力的优势菌种，首先从最有可能存在目标菌株的污泥（长期受甲苯和二甲苯污染的底泥），选取底泥放在30℃的水箱曝气培养，每日向其中加入营养物质和5ml到10ml的含甲苯和二甲苯的漆料，进行菌种的前期培养和驯化。
培养一段时间后从菌箱中取大约10ml到20ml的菌液，在无菌操作台上，通过平板划线法将其接种在固态培养基平板上，倒置放在37℃恒温箱进行培养，经过2—3天的时间，观察生长出的细菌为各种形态的混合菌，无法确定其是否具有降解甲苯或二甲苯的能力。
3.1.2驯化培养
对原菌液培养一段时间后，再进行平板划线分离，在原来的基础上向培养皿上滴加2到3 滴含有甲苯和二甲苯的漆料，进行驯化培养。2-3天后从中挑取能够存活的菌种，重复以上实验步骤，随着漆料浓度的增大，培养代数的增加，基本上有三到四种形态的菌落，将菌种用斜面保存。
3.2优势种分离
由于固态培养基给微生物提供了除漆料以外的碳源，所以无法确定这几种菌种究竟是能在富含甲苯和二甲苯的环境中生存还是能以甲苯和二甲苯为碳源生存，所以需要除去会干扰实验的碳源。
将保存在斜面上的菌种，在液态培养基（附录一）进行选种培养。将其中能以甲苯和二甲苯为唯一碳源的优势菌种用平板划线法进行分离纯化，然后继续增加漆料的浓度进行驯化培养，最终培养以甲苯和二甲苯为唯一碳源的优势菌种。
4优势种的初步鉴定
4.1染色鉴定
观察优势菌种的菌落特征，菌体结构，并对其进行革兰氏染色与芽孢染色。根据菌落特征和染色结果，查细菌鉴定手册，初步确定菌株所属类别。但是这只能找出菌株所在的属，而不能确定其具体的种类。所以要采用微生物鉴定系统进行进一步鉴定。
4.2 SherlockMIS鉴定（Sherlock Microbiol Identification System）
将培养的菌种，经过有机溶剂萃取脂肪酸成分和甲基化之后，注入GC分析系统进行分析，与Sherlock菌种标准数据库比对，软件会给出一个最相关的菌株，准确的判断待检测样品的菌种类型。
5实验结果
通过染色鉴定，大致能判断优势菌种是G+菌，通过SherlockMIS鉴定，大致能判断是芽孢杆菌菌属。
6结语
6.1本次试验以长期受甲苯和二甲苯污染的底泥为研究对象，经过驯化、分离、纯化过程得到能够高效降解甲苯和二甲苯的微生物。
6.2通过实验发现很难分离出单一的菌种，最后是几种不同形态的菌种，所以纯化培养耗时较长，以致于该试验持续进行了很长时间。
6.3本实验通过反复的分离驯化培养，最终确定能够降解甲苯和二甲苯的微生物
参考文献：
[1]朱志良，胡立志.甲苯的代谢、毒性与生物监测研究进展[J].职业医学，1995
[2]H. H. J. Cox， M. A. Deshusses. Co-treatment of H2S and toluene in a biotrickling filter[J].Chemical Engineering Journal，2002
[3]D. Urfer， P. M. Huck. Measurement of biomass activity in drinking water biofilters using a respirometric method[J]. Wat. Res.， 2001
[4]沈萍，范秀荣，李广武 微生物学实验（第三版），1999.6
附录一：
牛肉膏蛋白胨固态培养基配方
固态培养基配方和斜面培养基的配制（ 1000 mL）
大豆胰蛋白肉汤30.0g，琼脂15.0g，调节pH值至7.0。
液体选择培养基的配制（1000mL）
甲苯12mL（二甲苯12mL），MgCl2·6H2O 3.34g， KH2PO4 1.0g，NaH2PO4·3H2O1.0g，NH4Cl 2g，FeSO4·7 H2O 0.012g，MnSO4·7H2O 0.003g，ZnSO4·7 H2O 0.003g，CoSO4·7 H2O 0.001g，调节pH值至7.0。
作者简介：
王晓晴（1994.10～），女，山东省威海人，青岛市四方区青岛科技大学环境与安全工程学院专业 本科生。
关键词：低浓度甲苯废气;菌种驯化筛选;菌种鉴定
1实验基本流程
2实验方法
2.1培养基的制备
2.1.1培养基类型
牛肉膏蛋白胨固态培养基，液态培养基
2.1.2实验器皿和材料
高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、无菌操作台、脱脂棉、酒精灯、培养皿、试管、锥形瓶、玻璃棒、天平、药匙、烧杯、加热板、量筒、pH试纸等。
2.1.3配制过程
依据附录一的配方配制牛肉膏蛋白胨固态培养基
2.2培养基的灭菌
实验一般都要求实验材料进行无杂菌的纯培养，所以实验中所用的器材都要经过包装灭菌。
2.2.1干热灭菌法
将用锡箔纸包装好的培养皿、烧杯、玻璃棒等玻璃器皿放入电热干燥箱，将温度调至165°C后维持2h，灭菌好的器皿应保存完好，否则易染菌。
2.2.2高压蒸汽灭菌法
将完全溶解的培养基倒入锥形瓶，每个锥形瓶倒入150ml到200mL的培养基，分装好后，将锥形瓶口塞上脱脂棉，用锡箔纸密封。将物品放在高压蒸汽灭菌锅0.1MPa，121.5℃保持20～30分钟灭菌。
2.3培养基平板的制备
将高压蒸汽灭菌的培养基在室温下冷却到50℃左右，在无菌操作台上，将培养基倒入培养皿中，等其冷却凝固，制成平板。
3菌种的筛选和驯化
3.1菌种的培养
3.1.1初步培养
为了得到有降解甲苯和二甲苯能力的优势菌种，首先从最有可能存在目标菌株的污泥（长期受甲苯和二甲苯污染的底泥），选取底泥放在30℃的水箱曝气培养，每日向其中加入营养物质和5ml到10ml的含甲苯和二甲苯的漆料，进行菌种的前期培养和驯化。
培养一段时间后从菌箱中取大约10ml到20ml的菌液，在无菌操作台上，通过平板划线法将其接种在固态培养基平板上，倒置放在37℃恒温箱进行培养，经过2—3天的时间，观察生长出的细菌为各种形态的混合菌，无法确定其是否具有降解甲苯或二甲苯的能力。
3.1.2驯化培养
对原菌液培养一段时间后，再进行平板划线分离，在原来的基础上向培养皿上滴加2到3 滴含有甲苯和二甲苯的漆料，进行驯化培养。2-3天后从中挑取能够存活的菌种，重复以上实验步骤，随着漆料浓度的增大，培养代数的增加，基本上有三到四种形态的菌落，将菌种用斜面保存。
3.2优势种分离
由于固态培养基给微生物提供了除漆料以外的碳源，所以无法确定这几种菌种究竟是能在富含甲苯和二甲苯的环境中生存还是能以甲苯和二甲苯为碳源生存，所以需要除去会干扰实验的碳源。
将保存在斜面上的菌种，在液态培养基（附录一）进行选种培养。将其中能以甲苯和二甲苯为唯一碳源的优势菌种用平板划线法进行分离纯化，然后继续增加漆料的浓度进行驯化培养，最终培养以甲苯和二甲苯为唯一碳源的优势菌种。
4优势种的初步鉴定
4.1染色鉴定
观察优势菌种的菌落特征，菌体结构，并对其进行革兰氏染色与芽孢染色。根据菌落特征和染色结果，查细菌鉴定手册，初步确定菌株所属类别。但是这只能找出菌株所在的属，而不能确定其具体的种类。所以要采用微生物鉴定系统进行进一步鉴定。
4.2 SherlockMIS鉴定（Sherlock Microbiol Identification System）
将培养的菌种，经过有机溶剂萃取脂肪酸成分和甲基化之后，注入GC分析系统进行分析，与Sherlock菌种标准数据库比对，软件会给出一个最相关的菌株，准确的判断待检测样品的菌种类型。
5实验结果
通过染色鉴定，大致能判断优势菌种是G+菌，通过SherlockMIS鉴定，大致能判断是芽孢杆菌菌属。
6结语
6.1本次试验以长期受甲苯和二甲苯污染的底泥为研究对象，经过驯化、分离、纯化过程得到能够高效降解甲苯和二甲苯的微生物。
6.2通过实验发现很难分离出单一的菌种，最后是几种不同形态的菌种，所以纯化培养耗时较长，以致于该试验持续进行了很长时间。
6.3本实验通过反复的分离驯化培养，最终确定能够降解甲苯和二甲苯的微生物
参考文献：
[1]朱志良，胡立志.甲苯的代谢、毒性与生物监测研究进展[J].职业医学，1995
[2]H. H. J. Cox， M. A. Deshusses. Co-treatment of H2S and toluene in a biotrickling filter[J].Chemical Engineering Journal，2002
[3]D. Urfer， P. M. Huck. Measurement of biomass activity in drinking water biofilters using a respirometric method[J]. Wat. Res.， 2001
[4]沈萍，范秀荣，李广武 微生物学实验（第三版），1999.6
附录一：
牛肉膏蛋白胨固态培养基配方
固态培养基配方和斜面培养基的配制（ 1000 mL）
大豆胰蛋白肉汤30.0g，琼脂15.0g，调节pH值至7.0。
液体选择培养基的配制（1000mL）
甲苯12mL（二甲苯12mL），MgCl2·6H2O 3.34g， KH2PO4 1.0g，NaH2PO4·3H2O1.0g，NH4Cl 2g，FeSO4·7 H2O 0.012g，MnSO4·7H2O 0.003g，ZnSO4·7 H2O 0.003g，CoSO4·7 H2O 0.001g，调节pH值至7.0。
作者简介：
王晓晴（1994.10～），女，山东省威海人，青岛市四方区青岛科技大学环境与安全工程学院专业 本科生。