【摘 要】
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构建人锰超氧化物歧化酶的原核表达载体,对影响蛋白表达的因素进行探索,并初步检测其活性.以人293T细胞cDNA为模板,利用PCR方法克隆人锰超氧化物歧化酶基因,将其插入pET15b载
【机 构】
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暨南大学药学院,广州,510632;中国科学院广州生物医药与健康研究院分子医学中心,广州,510633
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构建人锰超氧化物歧化酶的原核表达载体,对影响蛋白表达的因素进行探索,并初步检测其活性.以人293T细胞cDNA为模板,利用PCR方法克隆人锰超氧化物歧化酶基因,将其插入pET15b载体中,经测序鉴定正确后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami,通过IPTG诱导,SDS-PAGE检测菌体总蛋白.利用SOD检测试剂盒检测粗提物的SOD活性.结果:PCR扩增了一个长597 bp的基因片断,该片断编码由198个氨基酸组成的成熟的人锰超氧化物歧化酶蛋白.经过IPTG诱导表达出约25 k的蛋白.优化的IPTG浓度为0.25 mmol/L,在1～6 h范围内随着诱导时间的增加表达量逐渐增加,IPTG总量一样的情况下分次加入比单次加入所诱导的目的蛋白产量高.SOD活性检测表明经过诱导表达的hMn-SOD具有SOD活性.结论:成功扩增人锰超氧化物歧化酶基因,并构建了原核表达载体,经过1PTG诱导表达的目的蛋白有SOD活性.
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