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【摘要】目的:建立血清酪氨酸酶活性检测的方法，并进行方法学评价。方法:采用酶速率法检测人类血清酪氨酸酶活性，应用NCCLS评价方案对方法进行线性、精密度、灵敏度、干扰试验和生理差异等方面的评估。同时对青年男性、女性各20例和7例黄褐斑女性患者检测血清酪氨酸酶活性，比较血清酪氨酸酶活性在正常男、女性间的差异，同时对黄褐斑女性患者血清酪氨酸酶活性进行初步分析。结果:血清酪氨酸酶活性检测有较好的检测范围和良好的线性范围，总CV为5．01％，总胆红素<150μmol／L、Hb<2．0g／L、TG<9．6mmol／L时及治疗剂量维生素C不影响检测结果。血清酪氨酸酶活性在男性和女性间存在较大差异，同时黄褐斑女性患者血清酪氨酸酶活性高于正常女性参考范围。结论：本方法可测定血清酪氨酸酶活性，方法学可信且能用于全自动生化分析仪，能提高检测效率及增加结果的准确性和可靠性。
【关键词】酪氨酸酶活性 方法学评价
Determination of serum human tyrosinase the establishment and assessment methods
Dai YuzhuSengXiongwenChen Zhiyong
【Abstract】Objective：To establish a method for determining serum tyrosinase activity，and to assess it．Methods：The serum tyrosinase activity was determined by the rate of emzyne reaction， using the NCCLS to assess the method，including linearity,accuracy,sensitivity， interferentialexamination and physical difference．Meanwhile，the serum tyrosinase activity was detected in 20 male youth．20 female youth and 7 female chloasma patients．The defference of serum tyrosinase activity was compared between the healthy male and female control groups，and used for primary analyse to serum tyrosinase activity of female patients．Results：The method had a wide detect range and a well lineage．and its total CV was 5．01％．Such that total bilirubin was less than 150μmol／L，Hb was less than 2．0μmol／L，TG was less than 9．6μmol／L and Vitamine C with cunring dosages can't affect the detection．Meanwhile．serum tyrosinase activity of female patients was higher than referrence range of healthy female contro1．Conclusion：The method can be used to detect serum tyrosinase activity,reliable and used in the full-automatic biochemistry analyse instrument with high efficiency and precise，reliable result．
【Key words】The activity of tyrosinaseMethodologlcal evaluation
酪氨酸酶(EC1．14．18．1，Tyrosinase)又称多酚氧化酶，是结构复杂的多亚基的含铜氧化还原酶，广泛存在于微生物、动植物及人体中。酪氨酸酶具有独特的双重催化功能，是生物体内黑色素合成的关键酶，与人的衰老，昆虫的伤口愈合与发育，果蔬的褐变有密切关系。鉴于临床需要，通过对文献［1、2、3］的调阅及对方法学的研究，建立了对人血清酪氨酸酶活性的全自动生化分析仪检测方法及相应的试剂。这将有利于临床大批量检测的需要，同时提高了结果的可重复性和准确度。
1材料与方法
1．1标本来源
1．1．1健康对照组：在我院体检的青年健康者，男性20人，平均年龄21．8岁，女性20人，平均年龄20．3岁。空腹采取静脉血，分离血清，-20℃保存待测。
1．1．2实验组：由皮肤科医生选择7名黄褐斑患者，女性，平均年龄35．6岁。空腹采取静脉血，分离血清，-20℃保存待测。
1．2试剂
1．2．1磷酸盐缓冲液(0．1mol／L PH 6．8)：分别称取磷酸二氢钾13．6g，磷酸氢二钠14．2g，分别溶于1L蒸馏水中，将两种磷酸盐溶液混合隔夜放置待反应平衡，校验pH后待用。
1．2．23mmol／L多巴溶液：称取L-多巴(SIGMA产品)59．16mg，用磷酸盐缓冲液定容至100ml。稳定3天。
1．2．33．0％过氧化氢溶液：吸取2ml的30％过氧化氢与18ml的PBS缓冲液混合。
1．2．4156000U／L酪氨酸酶贮存溶液：称取10mg蘑菇酪氨酸酶(SIGMA产品)，用磷酸盐缓冲液溶解定容至100ml。分装20℃保存待用。
1．2．51560U／L酪氨酸酶应用溶液：取1ml酪氨酸酶贮存液，用磷酸盐缓冲液稀释定容至100ml，此溶液酪氨酸酶活性为1560U／L。
1．2．6系列酪氨酸酶溶液：用磷酸盐缓冲液稀释酪氨酸酶应用液为0、39、78、156、312、390、624、780、1170、1560U／L。
1.3仪器
1．3．1美国Abbott公司AEROSET全自动生化分析仪。
1．3．2日本岛津UV-2001紫外可见分光光度计。
1．3．3日本岛津电子天平(0．000001g)。
1．4方法
1．4．1吸收光谱分析：取酪氨酸酶应用液0．4ml，加入多巴溶液3．4ml，混匀，37℃孵育5min，加入3．0％过氧化氢溶液0．2ml，37℃孵育5min，用多巴溶液作空白，UV-2001紫外可见分光光度计扫描反应液在340~600nm间吸收光谱曲线。
1．4．2酪氨酸酶活性检测参数：标本：40 μl；多巴溶液340μ1；过氧化氢溶液20μ1；波长475nm；反应类型：速率法升反应。多巴醌摩尔消光系数为3600，理论F值为2778。
1．4．3根据理论F值所得酶活性与系列酶溶液酶活性作相关性分析。
1．4．4方法学评价，参照文献［4、5］关于NCCLS评价方案实行相应方法学评价。
（1）线性评价：在健康对照组混合血清标本内加入不同体积的1560U／L酪氨酸酶应用液，成10个不同浓度的标本，随机排列，每个标本测定4次，分析在当天完成。进行线性回归分析。
（2）精密度：取健康对照组混合血清标本，和病理组混合血清标本各一份，2个标本每天测定2次(2次测定间隔大于2小时)，每次测定均作双份，共测定20天。每次测定做一个质控。
（3）灵敏度：将健康对照组混合血清标本倍比稀释作为待检标本，用蒸馏水作为空白，所测吸光度单位时间变化能区别于蒸馏水的最低酪氨酸酶活性为该法的灵敏度。
（4）干扰试验：在三份健康对照组混合血清标本中分别加入黄疸、溶血及脂血标本，另一份中加入等体积的蒸馏水，按比例分别混合成5个不同干扰物浓度，每份标本重复测定4次，计算分析干扰。在二份健康对照组混合血清标本中一份加入治疗剂量维生素C，另一份作对照，计算分析干扰。
1．4．5生理差异的初步评估：对男性和女性对照组血清酪氨酸酶活性进行统计学分析，评价生理差异，对7名黄褐斑患者血清酪氨酸酶活性与对照组比较，初步探索临床应用价值。
1．4．6统计方法：对重复性验证结果计算均数、标准差，对方法学比较结果进行配对资料t检验，采用SPSS 10．0 forWINDOWS统计软件包进行辅助分析。
2结果
2．1酶促反应产物多巴醌在475nm处有吸收峰，与文献相符。
2．2理论F值所得酶活性与系列酶溶液酶活性作相关性分析结果见图1。
两组数据间相关系数为0．9986，p<0．001
2．3线性评价
2．2．1线性回归分析：y=1．002 x+0．0078
2．2．2稀释变异试验：P=0．38，界限值P0.05=0．6841；P0.01=0．7814；P值0.05，稀释变异可接受。
2．2．3线性失拟检查：G=1．287，界限值F0.05=3．29； F0.01=5．42；G值0.05，说明线性良好。线性范围：3～1200U／L。
2．3精密度评价:日间CV=4．28％，批内CV=3．28％，批间CV=3．89％，总CV=5．01％。
2．4以蒸馏水作为标本，检测20次，吸光度95％可信区间为-0．004～0．009，能区别于蒸馏水标本的最低TYR浓度为最低可检出限为3U／L。
2．5干扰试验评价:总胆红素<150μmol／L、Hb<2．0g／L、TG<9．6mmol／L，治疗剂量维生素C不影响检测结果。
2．6．1男性血清酪氨酸酶活性(x±2SD)：103±49，n=20；女性血清酪氨酸酶活性(x±2SD)：74±52，n=20；女性黄褐斑患者血清酪氨酸酶活性(x±2SD)：1324±74，n=7。男性和女性间有显著性差异，t=3．316，p<0．001。
2．6．2女性黄褐斑患者血清酪氨酸酶活性显著高于正常女性，t=5．018，p<0．001。
3讨论
酪氨酸酶催化酪氨酸生成多巴，是黑色素合成过程中的关键酶，其活性的异常可能导致皮肤色素生成的异常，因此对酪氨酸酶的研究不断深入。通过对相关文献介绍酪氨酸酶检测方法的研究及重建发现，一些方法在实际检测过程中存在某些缺陷，使得检测结果不尽如人意。在临床研究及实践过程中，需要检测大量标本，并保证检测结果的准确性，就需要能用自动化分析仪来完成检测。完善检测方法，评估方法的可靠性，并使之能适用于自动化分析仪，是这次研究需要解决的问题。
由于在反应体系中缺乏供氧体，我们加入了H2O2，多巴可被H2O2缓慢氧化，为增加试剂的稳定性，将H2O2溶液作为试剂2，与底物溶液分离。底物溶液在4℃时开盖保存可稳定3天，由于空气中O2氧化多巴产生导致本底升高和底物浓度的降低，影响结果的准确性。
人类酪氨酸酶和蘑菇酪氨酸酶的催化活性接近，且相关良好，可以作为常规室内质量控制品。稀释变异可接受，因此采用生理盐水稀释血清标本对结果的影响处于可接受范围。方法的最低检出限为3U／L，日间CV=4．28％，批内CV=3．28％，批间CV=3．89％，总CV=5．01％，方法在0～1200U／L内线性良好，超过1200U／L可用生理盐水显稀释后检测。总胆红素<150μmol／L、Hb<2．0g／L、TG<9．6mmol／L，治疗剂量维生素C不影响检测结果。
正常男性血清酪氨酸酶活性为正态分布，并高于正常女性。女性血清酪氨酸酶活性为非止态分布，似乎受其它因素影响。初步检测7名女性黄褐斑患者血清酪氨酸酶活性显著高于正常女性，t=5．018，p<0．001。女性酪氨酸酶活性的影响因素尚需要进一步临床研究，女性黄褐斑患者血清酪氨酸酶活性升高原因可能与色素沉着有关，尚需要进一步的临床证据证明。
参考文献
1曾伟成，朱道清，酪氨酸酶催化反应机理的动力学分析.［J］数理医药学杂志，1999，12(2)158
2杨柳依，曹煜等，E$种中药提取成分对酪氨酸酶活性的抑制作用［J］.中华皮肤科杂志，2003，36(4)207-09
3曾伟成，郑能武，陈曾燮，维生素C对酪氨酸酶催化反应的影响［J］.中国生化药物杂志，2001，22(6)300-02
4杨昌国，许叶等，线性评价和干扰试验中NCCLS评价方案的应用［J］.临床检验杂志，1999，17(3)184-86
5杨昌国，许叶等，精密度评价和方法比较中NCCLS评价方案的应用［J］.临床检验杂志，1999．17(1)47-9
作者单位：310013浙江省杭州市中国人民解放军第117医院检验科
【关键词】酪氨酸酶活性 方法学评价
Determination of serum human tyrosinase the establishment and assessment methods
Dai YuzhuSengXiongwenChen Zhiyong
【Abstract】Objective：To establish a method for determining serum tyrosinase activity，and to assess it．Methods：The serum tyrosinase activity was determined by the rate of emzyne reaction， using the NCCLS to assess the method，including linearity,accuracy,sensitivity， interferentialexamination and physical difference．Meanwhile，the serum tyrosinase activity was detected in 20 male youth．20 female youth and 7 female chloasma patients．The defference of serum tyrosinase activity was compared between the healthy male and female control groups，and used for primary analyse to serum tyrosinase activity of female patients．Results：The method had a wide detect range and a well lineage．and its total CV was 5．01％．Such that total bilirubin was less than 150μmol／L，Hb was less than 2．0μmol／L，TG was less than 9．6μmol／L and Vitamine C with cunring dosages can't affect the detection．Meanwhile．serum tyrosinase activity of female patients was higher than referrence range of healthy female contro1．Conclusion：The method can be used to detect serum tyrosinase activity,reliable and used in the full-automatic biochemistry analyse instrument with high efficiency and precise，reliable result．
【Key words】The activity of tyrosinaseMethodologlcal evaluation
酪氨酸酶(EC1．14．18．1，Tyrosinase)又称多酚氧化酶，是结构复杂的多亚基的含铜氧化还原酶，广泛存在于微生物、动植物及人体中。酪氨酸酶具有独特的双重催化功能，是生物体内黑色素合成的关键酶，与人的衰老，昆虫的伤口愈合与发育，果蔬的褐变有密切关系。鉴于临床需要，通过对文献［1、2、3］的调阅及对方法学的研究，建立了对人血清酪氨酸酶活性的全自动生化分析仪检测方法及相应的试剂。这将有利于临床大批量检测的需要，同时提高了结果的可重复性和准确度。
1材料与方法
1．1标本来源
1．1．1健康对照组：在我院体检的青年健康者，男性20人，平均年龄21．8岁，女性20人，平均年龄20．3岁。空腹采取静脉血，分离血清，-20℃保存待测。
1．1．2实验组：由皮肤科医生选择7名黄褐斑患者，女性，平均年龄35．6岁。空腹采取静脉血，分离血清，-20℃保存待测。
1．2试剂
1．2．1磷酸盐缓冲液(0．1mol／L PH 6．8)：分别称取磷酸二氢钾13．6g，磷酸氢二钠14．2g，分别溶于1L蒸馏水中，将两种磷酸盐溶液混合隔夜放置待反应平衡，校验pH后待用。
1．2．23mmol／L多巴溶液：称取L-多巴(SIGMA产品)59．16mg，用磷酸盐缓冲液定容至100ml。稳定3天。
1．2．33．0％过氧化氢溶液：吸取2ml的30％过氧化氢与18ml的PBS缓冲液混合。
1．2．4156000U／L酪氨酸酶贮存溶液：称取10mg蘑菇酪氨酸酶(SIGMA产品)，用磷酸盐缓冲液溶解定容至100ml。分装20℃保存待用。
1．2．51560U／L酪氨酸酶应用溶液：取1ml酪氨酸酶贮存液，用磷酸盐缓冲液稀释定容至100ml，此溶液酪氨酸酶活性为1560U／L。
1．2．6系列酪氨酸酶溶液：用磷酸盐缓冲液稀释酪氨酸酶应用液为0、39、78、156、312、390、624、780、1170、1560U／L。
1.3仪器
1．3．1美国Abbott公司AEROSET全自动生化分析仪。
1．3．2日本岛津UV-2001紫外可见分光光度计。
1．3．3日本岛津电子天平(0．000001g)。
1．4方法
1．4．1吸收光谱分析：取酪氨酸酶应用液0．4ml，加入多巴溶液3．4ml，混匀，37℃孵育5min，加入3．0％过氧化氢溶液0．2ml，37℃孵育5min，用多巴溶液作空白，UV-2001紫外可见分光光度计扫描反应液在340~600nm间吸收光谱曲线。
1．4．2酪氨酸酶活性检测参数：标本：40 μl；多巴溶液340μ1；过氧化氢溶液20μ1；波长475nm；反应类型：速率法升反应。多巴醌摩尔消光系数为3600，理论F值为2778。
1．4．3根据理论F值所得酶活性与系列酶溶液酶活性作相关性分析。
1．4．4方法学评价，参照文献［4、5］关于NCCLS评价方案实行相应方法学评价。
（1）线性评价：在健康对照组混合血清标本内加入不同体积的1560U／L酪氨酸酶应用液，成10个不同浓度的标本，随机排列，每个标本测定4次，分析在当天完成。进行线性回归分析。
（2）精密度：取健康对照组混合血清标本，和病理组混合血清标本各一份，2个标本每天测定2次(2次测定间隔大于2小时)，每次测定均作双份，共测定20天。每次测定做一个质控。
（3）灵敏度：将健康对照组混合血清标本倍比稀释作为待检标本，用蒸馏水作为空白，所测吸光度单位时间变化能区别于蒸馏水的最低酪氨酸酶活性为该法的灵敏度。
（4）干扰试验：在三份健康对照组混合血清标本中分别加入黄疸、溶血及脂血标本，另一份中加入等体积的蒸馏水，按比例分别混合成5个不同干扰物浓度，每份标本重复测定4次，计算分析干扰。在二份健康对照组混合血清标本中一份加入治疗剂量维生素C，另一份作对照，计算分析干扰。
1．4．5生理差异的初步评估：对男性和女性对照组血清酪氨酸酶活性进行统计学分析，评价生理差异，对7名黄褐斑患者血清酪氨酸酶活性与对照组比较，初步探索临床应用价值。
1．4．6统计方法：对重复性验证结果计算均数、标准差，对方法学比较结果进行配对资料t检验，采用SPSS 10．0 forWINDOWS统计软件包进行辅助分析。
2结果
2．1酶促反应产物多巴醌在475nm处有吸收峰，与文献相符。
2．2理论F值所得酶活性与系列酶溶液酶活性作相关性分析结果见图1。
两组数据间相关系数为0．9986，p<0．001
2．3线性评价
2．2．1线性回归分析：y=1．002 x+0．0078
2．2．2稀释变异试验：P=0．38，界限值P0.05=0．6841；P0.01=0．7814；P值
2．2．3线性失拟检查：G=1．287，界限值F0.05=3．29； F0.01=5．42；G值
2．3精密度评价:日间CV=4．28％，批内CV=3．28％，批间CV=3．89％，总CV=5．01％。
2．4以蒸馏水作为标本，检测20次，吸光度95％可信区间为-0．004～0．009，能区别于蒸馏水标本的最低TYR浓度为最低可检出限为3U／L。
2．5干扰试验评价:总胆红素<150μmol／L、Hb<2．0g／L、TG<9．6mmol／L，治疗剂量维生素C不影响检测结果。
2．6．1男性血清酪氨酸酶活性(x±2SD)：103±49，n=20；女性血清酪氨酸酶活性(x±2SD)：74±52，n=20；女性黄褐斑患者血清酪氨酸酶活性(x±2SD)：1324±74，n=7。男性和女性间有显著性差异，t=3．316，p<0．001。
2．6．2女性黄褐斑患者血清酪氨酸酶活性显著高于正常女性，t=5．018，p<0．001。
3讨论
酪氨酸酶催化酪氨酸生成多巴，是黑色素合成过程中的关键酶，其活性的异常可能导致皮肤色素生成的异常，因此对酪氨酸酶的研究不断深入。通过对相关文献介绍酪氨酸酶检测方法的研究及重建发现，一些方法在实际检测过程中存在某些缺陷，使得检测结果不尽如人意。在临床研究及实践过程中，需要检测大量标本，并保证检测结果的准确性，就需要能用自动化分析仪来完成检测。完善检测方法，评估方法的可靠性，并使之能适用于自动化分析仪，是这次研究需要解决的问题。
由于在反应体系中缺乏供氧体，我们加入了H2O2，多巴可被H2O2缓慢氧化，为增加试剂的稳定性，将H2O2溶液作为试剂2，与底物溶液分离。底物溶液在4℃时开盖保存可稳定3天，由于空气中O2氧化多巴产生导致本底升高和底物浓度的降低，影响结果的准确性。
人类酪氨酸酶和蘑菇酪氨酸酶的催化活性接近，且相关良好，可以作为常规室内质量控制品。稀释变异可接受，因此采用生理盐水稀释血清标本对结果的影响处于可接受范围。方法的最低检出限为3U／L，日间CV=4．28％，批内CV=3．28％，批间CV=3．89％，总CV=5．01％，方法在0～1200U／L内线性良好，超过1200U／L可用生理盐水显稀释后检测。总胆红素<150μmol／L、Hb<2．0g／L、TG<9．6mmol／L，治疗剂量维生素C不影响检测结果。
正常男性血清酪氨酸酶活性为正态分布，并高于正常女性。女性血清酪氨酸酶活性为非止态分布，似乎受其它因素影响。初步检测7名女性黄褐斑患者血清酪氨酸酶活性显著高于正常女性，t=5．018，p<0．001。女性酪氨酸酶活性的影响因素尚需要进一步临床研究，女性黄褐斑患者血清酪氨酸酶活性升高原因可能与色素沉着有关，尚需要进一步的临床证据证明。
参考文献
1曾伟成，朱道清，酪氨酸酶催化反应机理的动力学分析.［J］数理医药学杂志，1999，12(2)158
2杨柳依，曹煜等，E$种中药提取成分对酪氨酸酶活性的抑制作用［J］.中华皮肤科杂志，2003，36(4)207-09
3曾伟成，郑能武，陈曾燮，维生素C对酪氨酸酶催化反应的影响［J］.中国生化药物杂志，2001，22(6)300-02
4杨昌国，许叶等，线性评价和干扰试验中NCCLS评价方案的应用［J］.临床检验杂志，1999，17(3)184-86
5杨昌国，许叶等，精密度评价和方法比较中NCCLS评价方案的应用［J］.临床检验杂志，1999．17(1)47-9
作者单位：310013浙江省杭州市中国人民解放军第117医院检验科