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【摘 要】乙型肝炎是世界上最常见的传染病之一，世界卫生组织（WHO）估计，本病每年造成100万人死亡。慢性乙型肝炎是HBV感染的一种严重后果。HBV-DNA是直接反映乙肝病毒存在、活动性复制及具有传染性的可靠指标。但目前我国现状HBV感染者多以其血清感染标志物（乙肝两对半，HBV-M）判定，由于其组合模式复杂多样，从而导致了临床上对部分发病患者的HBV感染复制状况难以判断，有时甚至会出现漏诊的情况。定量PCR法的应用，使得我们进行HBV-DNA的检测的同时得以对其进行相对的量化，这对于乙肝患者体内的HBV的复制以及传染性有更直接的了解，同时也更有利于对临床HBV感染的诊断、治疗方案的选择及疗效的判断。本文采用荧光定量PCR（FQ-PCR）对105例疑似乙肝患者标本血清的不同HBV血清学标志物组合进行了HBV-DNA检测，并对结果进行了统计学处理，以探讨HBV-M与HBV-DNA复制水平的关系，现报告如下：
【关键词】乙型肝炎；酶联免疫吸附试验（ELISA法）；荧光定量PCR（FQ-PCR）法
【中图分类号】R446.62 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0590-02
1 资料与方法
1.1 标本来源：均系2012年1月至2012年8月到我院（溧水人民医院）就诊的所有同时做过乙肝两对半及HBV-DNA检测的疑似乙肝的门诊和住院患者，共105例，其中女44人，男61人，年龄17～78岁，平均39岁。
1.2 检测仪器
1.2.1 ABI7300定量扩增仪（美国）。
1.2.2 Alisei全自动酶标仪（德国）。
1.3 检测方法和试剂
1.3.1 HBV-M检测：用酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测，试剂由上海荣盛生物技术有限公司提供，并严格按说明书操作。
1.3.2 HBV-DNA定量分析：采用荧光定量PCR（FQ-PCR）法检测，试剂由艾康生物科技发展有限公司提供，严格按说明书的步骤进行操作检测方法FQ-PCR法是在常规PCR基础上，添加了一条标记荧光发光分子和一个荧光淬灭分子的双标记探针，前者标记5"端，后者标记在3"端。完整的探针在激光激发下，发光分子所产生的荧光被淬灭分子全部吸收，从而无荧光。PCR扩增中Taq酶在链延长过程中可以通过自身的5"→3"核酸外切酶活性而降解，与模板结合的特异性荧光探针（切口平移效应）[1]，使得荧光发光分子从探针上切下，而与荧光淬灭分子分开，从而在激光激发下产生特定波长的荧光。这种荧光随着PCR扩增过程而动态性增强。FQ-PCR仪通过全过程动态监测可以得到每一个样品实际扩增曲线以找到PCR扩增的对数期，比较标准样品（单位：拷贝数/ml）的对数期，得出每一样品特定模板DNA的起始拷贝数/ml。
定量范围为0～1010/ml，定量准确度为±100%。
本法操作是用常规的碱裂解法从血清中提取HBV-DNA。各反应管放入ABI7300自动荧光检测仪，按下列条件扩增：93℃ 2 min预变性，然后按照93℃45 s，55℃120 s，共经40个循环后，由仪器软件自动分析计算出定量结果。
定量结果采用计算对数平均值的方法来计算HBV-DNA平均拷贝数，遇有阴性结果，不参加平均值的统计。其单位采用：拷贝数/ml。
2 结果
2.1 HBV-DNA定量测定结果：105例疑似乙肝患者血清标本中，57例HBV-DNA阳性，48例阴性，阳性最低拷贝数为1.30E+03copy/ml，最高拷贝数为7.70E+06copy/ml。
3 讨论
FQ-PCR是进行临床基因诊断的有效手段，它采用了完全闭管检测，不需要PCR后处理，避免了交叉感染；同时采用实时检测技术，所得Ct值和原始模板数量完全呈线形相关，定量准确率极高，它不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。
ELISA法检测乙肝两对半是临床诊断HBV感染的传统手段，它检测的是人体对HBV的免疫反应状态，而FQ-PCR则可以准确的反应出HBV-DNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情况等。本文通过实验结果显示，31例大三阳组中，其HBV-DNA阳性28例，检出率达90.15%，而且呈较高的拷贝量，经统计学处理大三阳组和HBsAg（+）HBcAb（+）组与小三阳组有显著性差异，说明这些患者HBV具有较高的复制水平，是具有传染性的重要标志。
35例小三阳血清中9例检出HBV-DNA阳性，检出率为27.78%，平均拷贝数达到3.79E+05拷贝数/ml，虽然其拷贝数和阳性率均低于大三阳组，但仍然具有较强的传染性，说明HBeAb的存在并不表示患者体内没有病毒复制，与既往文献报道结果吻合。
在20例HBsAg（+）HBcAb（+）血清中，有18例检出HBV-DNA阳性，检出率为90%，平均拷贝数为2.85E+04/ml，提示该组中的病人仍具有较强的病毒复制，传染性强。
在5例HBsAb（+）血清中，仍检测出1例HBV-DNA阳性，检出率为20%，平均拷贝数为1.13E+04拷贝数/ml，6例HBcAb（+）血清中1例检出HBV-DNA阳性，
检出率为16.67%，平均拷贝数3.12E+04拷贝数/ml，说明HBsAb产生和HBeAg转阴并不意味着病毒的复制停止或减弱。有学者证明乙型肝炎HBsAb出现后，血清内仍有DNA复制，随着时间的推移HBV-DNA的检出率逐渐下降。
4例乙肝两对半全阴性的病人中仍有1例HBV-DNA阳性，平均拷贝数为9.8E+02拷贝数/ml，阳性率为25%，据国内外文献报道证实HBV-DNA的出现早于其他血清标志物[2]，因此该l例受检者可能处于早期感染。乙肝两对半标志物全阴性的病人不能排除HBV感染。因此PCR的高灵敏度可作为早期诊断HBV感染提供依据，提示在临床上对HBV-M均阴性者，有进一步进行HBV-DNA、FQ-PCR检测的必要，以确立有无HBV感染。
综上所述，本研究结果表明，PCR与ELISA两种方法检测HBV感染与复制，多种血清学标志物模式都有一定的HBV-DNA检出率，由于DNA阳性表示HBV在体内复制，如果仅以HBV-M的检测结果作为判断HBV-DNA感染、传染性以及HBV是否在体内复制有一定的局限性，因此，为临床提供HBV感染、复制及传染性判断以及指导治疗和观察疗效，我们应选择乙肝两对半标志物并同时做HBV-DNA的荧光定量PCR检测[3]。
参考文献：
[1] Holland P M，Abramson R D，Watson R，et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5"to 3"exonuclease activity of the thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Nat Aca Sci USA，1991；88∶7276
[2] 资料来源：2005年12月2日由中华医学会肝病学分会和中华医学会传染病学分会联合制订的《慢性乙型肝炎防治指南》
[3] 九健康网“乙型肝炎病毒的致病性与免疫性”
【关键词】乙型肝炎；酶联免疫吸附试验（ELISA法）；荧光定量PCR（FQ-PCR）法
【中图分类号】R446.62 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0590-02
1 资料与方法
1.1 标本来源：均系2012年1月至2012年8月到我院（溧水人民医院）就诊的所有同时做过乙肝两对半及HBV-DNA检测的疑似乙肝的门诊和住院患者，共105例，其中女44人，男61人，年龄17～78岁，平均39岁。
1.2 检测仪器
1.2.1 ABI7300定量扩增仪（美国）。
1.2.2 Alisei全自动酶标仪（德国）。
1.3 检测方法和试剂
1.3.1 HBV-M检测：用酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测，试剂由上海荣盛生物技术有限公司提供，并严格按说明书操作。
1.3.2 HBV-DNA定量分析：采用荧光定量PCR（FQ-PCR）法检测，试剂由艾康生物科技发展有限公司提供，严格按说明书的步骤进行操作检测方法FQ-PCR法是在常规PCR基础上，添加了一条标记荧光发光分子和一个荧光淬灭分子的双标记探针，前者标记5"端，后者标记在3"端。完整的探针在激光激发下，发光分子所产生的荧光被淬灭分子全部吸收，从而无荧光。PCR扩增中Taq酶在链延长过程中可以通过自身的5"→3"核酸外切酶活性而降解，与模板结合的特异性荧光探针（切口平移效应）[1]，使得荧光发光分子从探针上切下，而与荧光淬灭分子分开，从而在激光激发下产生特定波长的荧光。这种荧光随着PCR扩增过程而动态性增强。FQ-PCR仪通过全过程动态监测可以得到每一个样品实际扩增曲线以找到PCR扩增的对数期，比较标准样品（单位：拷贝数/ml）的对数期，得出每一样品特定模板DNA的起始拷贝数/ml。
定量范围为0～1010/ml，定量准确度为±100%。
本法操作是用常规的碱裂解法从血清中提取HBV-DNA。各反应管放入ABI7300自动荧光检测仪，按下列条件扩增：93℃ 2 min预变性，然后按照93℃45 s，55℃120 s，共经40个循环后，由仪器软件自动分析计算出定量结果。
定量结果采用计算对数平均值的方法来计算HBV-DNA平均拷贝数，遇有阴性结果，不参加平均值的统计。其单位采用：拷贝数/ml。
2 结果
2.1 HBV-DNA定量测定结果：105例疑似乙肝患者血清标本中，57例HBV-DNA阳性，48例阴性，阳性最低拷贝数为1.30E+03copy/ml，最高拷贝数为7.70E+06copy/ml。
3 讨论
FQ-PCR是进行临床基因诊断的有效手段，它采用了完全闭管检测，不需要PCR后处理，避免了交叉感染；同时采用实时检测技术，所得Ct值和原始模板数量完全呈线形相关，定量准确率极高，它不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。
ELISA法检测乙肝两对半是临床诊断HBV感染的传统手段，它检测的是人体对HBV的免疫反应状态，而FQ-PCR则可以准确的反应出HBV-DNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情况等。本文通过实验结果显示，31例大三阳组中，其HBV-DNA阳性28例，检出率达90.15%，而且呈较高的拷贝量，经统计学处理大三阳组和HBsAg（+）HBcAb（+）组与小三阳组有显著性差异，说明这些患者HBV具有较高的复制水平，是具有传染性的重要标志。
35例小三阳血清中9例检出HBV-DNA阳性，检出率为27.78%，平均拷贝数达到3.79E+05拷贝数/ml，虽然其拷贝数和阳性率均低于大三阳组，但仍然具有较强的传染性，说明HBeAb的存在并不表示患者体内没有病毒复制，与既往文献报道结果吻合。
在20例HBsAg（+）HBcAb（+）血清中，有18例检出HBV-DNA阳性，检出率为90%，平均拷贝数为2.85E+04/ml，提示该组中的病人仍具有较强的病毒复制，传染性强。
在5例HBsAb（+）血清中，仍检测出1例HBV-DNA阳性，检出率为20%，平均拷贝数为1.13E+04拷贝数/ml，6例HBcAb（+）血清中1例检出HBV-DNA阳性，
检出率为16.67%，平均拷贝数3.12E+04拷贝数/ml，说明HBsAb产生和HBeAg转阴并不意味着病毒的复制停止或减弱。有学者证明乙型肝炎HBsAb出现后，血清内仍有DNA复制，随着时间的推移HBV-DNA的检出率逐渐下降。
4例乙肝两对半全阴性的病人中仍有1例HBV-DNA阳性，平均拷贝数为9.8E+02拷贝数/ml，阳性率为25%，据国内外文献报道证实HBV-DNA的出现早于其他血清标志物[2]，因此该l例受检者可能处于早期感染。乙肝两对半标志物全阴性的病人不能排除HBV感染。因此PCR的高灵敏度可作为早期诊断HBV感染提供依据，提示在临床上对HBV-M均阴性者，有进一步进行HBV-DNA、FQ-PCR检测的必要，以确立有无HBV感染。
综上所述，本研究结果表明，PCR与ELISA两种方法检测HBV感染与复制，多种血清学标志物模式都有一定的HBV-DNA检出率，由于DNA阳性表示HBV在体内复制，如果仅以HBV-M的检测结果作为判断HBV-DNA感染、传染性以及HBV是否在体内复制有一定的局限性，因此，为临床提供HBV感染、复制及传染性判断以及指导治疗和观察疗效，我们应选择乙肝两对半标志物并同时做HBV-DNA的荧光定量PCR检测[3]。
参考文献：
[1] Holland P M，Abramson R D，Watson R，et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5"to 3"exonuclease activity of the thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Nat Aca Sci USA，1991；88∶7276
[2] 资料来源：2005年12月2日由中华医学会肝病学分会和中华医学会传染病学分会联合制订的《慢性乙型肝炎防治指南》
[3] 九健康网“乙型肝炎病毒的致病性与免疫性”