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【摘要】目的建立水溶性维生素中维生素B12的含量测定方法。方法参照《中华人民共和国药典》二部中维生素B12的含量测定方法进行方法学考察。结果维生素B12质量浓度在1.0295μg/mL-4.1179μg/mL范围内与峰面积线性关系良好，样品平均回收率为99.87%。结论该方法专属性良好、准确度高、耐用性好、具有良好的稳定性。适合作为水溶性维生素中维生素B12的含量测定方法。
【关键词】含量测定；水溶性维生素；维生素B12
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.05.599文章编号：1004-7484（2014）-05-2868-02
1资料与方法
1.1仪器高效液相色谱仪（岛津LC-10ATvp溶剂输送泵与岛津SPD-10Avp紫外-可见检测器），配有LC-solution色谱工作站。
1.2色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填料。
1.2.1梯度洗脱流动相A精密称取磷酸氢二钾0.87g，磷酸二氢钾0.41g，用水溶解后加乙腈125ml，用水稀释至1000ml，pH值為7.5。
1.2.2流动相B水-乙腈-磷酸（499∶499∶2）。检测波长360nm，柱温40℃，维生素B12与未知峰之间的分离度应大于1.0。
1.3系统适用性试验
1.3.1空白溶液的制备按制剂处方工艺制备（不含维生素B12）空白100瓶量，混匀。取5瓶量，置25ml容量瓶中，加适量水溶解并用水稀释至刻度，摇匀，即得。取30μl注入液相色谱仪，结果空白溶液不干扰维生素B12的含量测定。
1.3.2维生素B12对照品溶液的制备取维生素B12对照品25mg，精密称定，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml置100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。取30μl注入液相色谱仪，结果维生素B12与未知峰之间的分离度大于1.0。
1.3.3供试品溶液的制备取本品5瓶，用适量水溶解后移置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即得。取30μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果维生素B12与未知峰之间的分离度大于1.0。
1.4含量测定方法学研究
1.4.1标准曲线的建立精密称取维生素B12对照品10.78mg，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取该溶液1.0、1.6、2.0、2.4、4.0ml，分别置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。上述各浓度的溶液分别进样15μl，记录色谱图。以峰面积（A）为纵坐标，进样量（X）为横坐标，进行线性回归，得回归方程。维生素B12在进样量为1.0295μg/mL-4.1179μg/mL的范围内与峰面积具有良好的线性关系。
1.4.2溶液稳定性试验取本品5瓶，用适量水溶解后移至25ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即得。定时取样测定，考察峰面积变化程度。样品溶液在8小时之内稳定。
1.4.3进样精密度试验取本品5瓶，用适量水溶解后移至25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即得。精密量取30μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。平行进样6次，考察峰面积变化程度。结果表明该含量测定方法精密度良好。
1.4.4回收率试验精密称取维生素B12原料药19.11mg、19.32mg、19.31mg、27.39mg、26.31mg、26.24mg、31.11mg、30.83mg、31.38mg分别置于500ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml置50ml量瓶中，按制剂处方量加入不含维生素B12的空白，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取维生素B12对照品适量，依法制备对照品溶液，计算回收率，见表1。
1.4.5重复性试验取注射用水溶性维生素3瓶、维生素B12对照品25mg，依法配制成溶液，进行含量测定，平行操作6份，见表2。
1.4.6中间精密度试验对同一批次供试品在不同的仪器上由不同的实验人员在不同的时间按照上述方法分别进行6次分析验证，见表3。
1.5含量测定对照品溶液的制备：取维生素B12对照品25mg，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备：取本品5瓶，用适量水溶解后移至25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即得。
测定法：取对照品溶液和供试品溶液各30μl，分别注入液相色谱仪，测定，用外标法计算，即得，见表5。
2结论
该方法在1.0295μg/mL-4.1179μg/mL之间具有良好的线性关系，具有良好的稳定性，专属性良好、准确度高、耐用性好、适合作为水溶性维生素中维生素B12的含量测定方法。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[M].中国医药科技出版社，2010：901.
【关键词】含量测定；水溶性维生素；维生素B12
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.05.599文章编号：1004-7484（2014）-05-2868-02
1资料与方法
1.1仪器高效液相色谱仪（岛津LC-10ATvp溶剂输送泵与岛津SPD-10Avp紫外-可见检测器），配有LC-solution色谱工作站。
1.2色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填料。
1.2.1梯度洗脱流动相A精密称取磷酸氢二钾0.87g，磷酸二氢钾0.41g，用水溶解后加乙腈125ml，用水稀释至1000ml，pH值為7.5。
1.2.2流动相B水-乙腈-磷酸（499∶499∶2）。检测波长360nm，柱温40℃，维生素B12与未知峰之间的分离度应大于1.0。
1.3系统适用性试验
1.3.1空白溶液的制备按制剂处方工艺制备（不含维生素B12）空白100瓶量，混匀。取5瓶量，置25ml容量瓶中，加适量水溶解并用水稀释至刻度，摇匀，即得。取30μl注入液相色谱仪，结果空白溶液不干扰维生素B12的含量测定。
1.3.2维生素B12对照品溶液的制备取维生素B12对照品25mg，精密称定，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml置100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。取30μl注入液相色谱仪，结果维生素B12与未知峰之间的分离度大于1.0。
1.3.3供试品溶液的制备取本品5瓶，用适量水溶解后移置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即得。取30μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果维生素B12与未知峰之间的分离度大于1.0。
1.4含量测定方法学研究
1.4.1标准曲线的建立精密称取维生素B12对照品10.78mg，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取该溶液1.0、1.6、2.0、2.4、4.0ml，分别置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。上述各浓度的溶液分别进样15μl，记录色谱图。以峰面积（A）为纵坐标，进样量（X）为横坐标，进行线性回归，得回归方程。维生素B12在进样量为1.0295μg/mL-4.1179μg/mL的范围内与峰面积具有良好的线性关系。
1.4.2溶液稳定性试验取本品5瓶，用适量水溶解后移至25ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即得。定时取样测定，考察峰面积变化程度。样品溶液在8小时之内稳定。
1.4.3进样精密度试验取本品5瓶，用适量水溶解后移至25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即得。精密量取30μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。平行进样6次，考察峰面积变化程度。结果表明该含量测定方法精密度良好。
1.4.4回收率试验精密称取维生素B12原料药19.11mg、19.32mg、19.31mg、27.39mg、26.31mg、26.24mg、31.11mg、30.83mg、31.38mg分别置于500ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml置50ml量瓶中，按制剂处方量加入不含维生素B12的空白，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取维生素B12对照品适量，依法制备对照品溶液，计算回收率，见表1。
1.4.5重复性试验取注射用水溶性维生素3瓶、维生素B12对照品25mg，依法配制成溶液，进行含量测定，平行操作6份，见表2。
1.4.6中间精密度试验对同一批次供试品在不同的仪器上由不同的实验人员在不同的时间按照上述方法分别进行6次分析验证，见表3。
1.5含量测定对照品溶液的制备：取维生素B12对照品25mg，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备：取本品5瓶，用适量水溶解后移至25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即得。
测定法：取对照品溶液和供试品溶液各30μl，分别注入液相色谱仪，测定，用外标法计算，即得，见表5。
2结论
该方法在1.0295μg/mL-4.1179μg/mL之间具有良好的线性关系，具有良好的稳定性，专属性良好、准确度高、耐用性好、适合作为水溶性维生素中维生素B12的含量测定方法。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[M].中国医药科技出版社，2010：901.