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[摘要] 目的 分析胃炎组织、不典型增生组织和癌组织中Ki67和p16的表达情况，探讨其与胃组织癌变的关系及作为早期癌变生物学标志的可能性。 方法 应用免疫组织化学SP法对22例胃炎组织、80例不典型增生组织及6O例胃癌组织中的Ki67和pl6的表达情况进行检测。 结果 在胃炎组织、不典型增生组织及胃癌组织中Ki67则呈递增趋势，而pl6的表达阳性率呈递减趋势；结果显示Ki67和pl6表达阳性率与胃黏膜组织从胃炎至不典型增生再至癌变这一过程均相关（P＜0.05）。Ki67的表达与胃癌的Lauren分型、浸润深度、淋巴结转移有关，与分化程度无关。Pl6的表达与胃癌的Lauren分型、分化程度、浸润深度无关，与淋巴结转移有关。Ki67和pl6的表达在胃癌组织中呈负相关（P＜0.05）。 结论Ki67和pl6的表达异常与胃癌的癌变过程相关，两者有可能成为胃组织早期癌变的分子标记物。
[关键词] 胃炎；不典型增生；胃癌；Ki67；p16
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）09-32-05
Exploration of expression of Ki67 and pl6 in gastric cancer and their correlation
JIA Zhenjun MIAO Xindong ZANG Xueliang GUO Xuejie
Department of Pathology,Shandong Aluminum Company Hospital,Zibo 255069,China
[Abstract] Objective To analyze the expression situation of Ki67 and p16 in gastritis tissue, dysplasia tissue and cancer tissue and explore their relationship to gastric tissue canceration and their possibility of being biological markers of early canceration. Methods The immunohistochemical SP method was used to detect the expression situation of Ki67 and p16 in 22 cases of gastritis tissue,80 cases of dysplasia tissue and 60 cases of cancer tissue. Results In gastritis tissue, dysplasia tissue and cancer tissue,Ki67 presented an ascending trend and the positive expression rate of p16 presented a descending trend.The results showed that the positive expression rates of Ki67 and p16 and the gastric mucosal tissue were correlated to each other from gastric cancer to dysplasia and from dysplasia to canceration(P＜0.05).The expression of Ki67 was correlated to the Lauren typing,invasion depth and lymphatic metastasis of gastric cancer,but not correlated to the differentiation degree.The expression of p16 was correlated to the Lauren typing, differentiation degree and invasion depth of gastric cancer,but not correlated to the lymphatic metastasis. The expression of Ki67 and p16 in gastric cancer tissue were negatively correlated(P＜0.05). Conclusion The abnormal expression of Ki67 and p16 relates to the canceration process of gastric cancer and both may become the molecular markers of the early canceration of gastric tissue.
[Key words] Gastritis;Dysplasia;Gastric cancer;Ki67;p16
胃癌的發生和发展涉及许多肿瘤抑制基因和肿瘤相关基因[1]，增殖核抗原Ki67是与细胞周期密切相关的细胞增殖标记物，其增殖指数与许多肿瘤的分化程度、浸润转移及预后密切相关。p16既是正常细胞周期的有效调控者，又是抑制肿瘤生长的关键因子，该蛋白通过阻止Rb蛋白的磷酸化，而抑制细胞分裂、增殖。当p16蛋白不能正常表达时，可能是p16基因发生纯合缺失、DNA异常甲基化、点突变、杂合缺失，使细胞分裂、增殖失控而发生癌变。我们承担了慢性胃炎与胃癌及邻癌黏膜的对比研
究项目，目前正在大量搜集资料，本研究采用免疫组化SP法对22例胃炎、80例不典型增生及60例胃癌组织中的增殖核抗原Ki67和抑癌基因p16蛋白进行了回顾性检测，旨在探讨Ki67与p16蛋白在胃炎、不典型增生及胃癌中的表达变化并探讨其意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选用山东铝业公司医院病理科2010年12月～2013年12月的胃镜活检组织102例，胃癌手术切除标本60例。男103例，女59例；平均年龄53.4岁。标本分为：（1）胃炎组织22例；（2）胃不典型增生组织80例；（3）胃癌组织60例；组织类型包括肠型（高分化腺癌、中分化腺癌）20例和弥漫型（低分化腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌、未分化癌）40例。
1.2 方法
所有标本均经10%中性福尔马林液固定，3μm连续切片，分别作HE和免疫组织化学染色。常规HE染色，观察胃癌的病理形态、浸润深度、脉管浸润、淋巴结转移等。单克隆抗体Ki67、p16及PV9000检测试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，免疫组织化学染色采用SP法。切片脱蜡至水，柠檬酸（pH6.0）高压蒸汽修复100℃、5min，PBS冲洗2min×3次；3%H2O2去离子水孵育室温15min，PBS冲洗2min×3次；滴加一抗Ki67和p16室温或37℃孵育1~2h或4℃冰箱过夜，PBS冲洗2min×3次；滴加通用型IgG抗体-HRP多聚体，室温或37℃孵育15min，PBS冲洗2min×3次；DAB显色，在显微镜下观察终止显色；复染，中性树胶封片，光学显微镜下观察。每批染色均设立阳性、阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 免疫组化结果判读
Ki67细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞。p16蛋白阳性定位主要在细胞核，也可在细胞质，细胞核或细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。取3个高倍镜视野中阳性细胞所占的细胞百分比的平均值，根据阳性肿瘤细胞占全部肿瘤细胞的比例将其分为：（１）阳性细胞数＜10%为阴性（—）；（２）阳性细胞数占10%～25%为（+）；（３）阳性细胞占25%～50%为（++）；（４）阳性细胞＞50%为（+++）。
图1 Ki67在胃炎组织的表达（40×10）
图2 Ki67 在胃不典型增生组织的表达（40×10）
图3 Ki67 在胃癌组织的表达（40×10）
图4 p16在胃炎组织的表达（40×10）
图5 p16 在胃肠化生组织的表达（40×10）
表1 胃炎组织、不典型增生组织和癌组织中Ki67与pl6的表达
组别 n Ki67表达强度（例） Ki67表达阳性率
（%） p16表达强度（例） p16表达阳性率
（%）
（-） （+） （++） （+++） （-） （+） （++） （+++）
胃炎组织 22 16 4 2 0 27.27 2 14 4 2 90.90
不典型增生 80 49 15 12 4 38.75 10 47 20 2 86.25
轻 26 18 4 4 0 30.77 2 14 8 1 88.46
中 30 20 5 4 1 33.33 4 17 8 1 86.67
重 24 11 6 4 3 54.17 4 16 4 0 83.33
胃癌组 60 17 27 9 5 71.67 32 22 6 0 46.67
表2 p16和Ki67表达与胃癌病理特征的关系
病理特征 n p16 ki67
缺失率[%（n）] x2 P 阳性率[%（n）] x2 P
Lauren分型 0.134 0.714＞0.05 10.506 0.001＜0.05
肠型 20 50.00（10） 45.00（9）
弥漫性 40 55.00（22） 85.00（34）
分化程度 3.839 0.147＞0.05 68.18（15） 1.037 0.595＞0.05
高 18 38.89（7） 66.67（12）
中 22 50.00（11） 68.18（15）
低 20 70.00（14） 80.00（16）
浸润深度 0.834 0.361＞0.05 17.709 0.000＜0.05
浆膜内 25 48.00（25） 68.00（17）
浆膜及浆膜外 35 57.14（20） 74.28（26）
淋巴结转移 5.757 0.016＜0.05 5.180 0.023＜0.05
无 25 44.00（11） 56.00（14）
有 35 60.00（21） 82.86（29）
图6 p16 在胃癌组织的表达（40×10）
1.4 统计学处理
采用SPSS17.0统计软件包进行数据处理，行x2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 胃炎组织、不典型增生组织和癌组织中Ki67与pl6的表达情况
在胃炎中p16主要表达在固有腺体的细胞核和胞浆中，而Ki67则以腺体颈细胞核为主，从不典型增生开始分布失去规律。胃炎组织→胃不典型增生组织→胃癌组织中p16表达阳性率呈递减趋势（x2=19.840，P=0.000＜0.05），Ki67的表达阳性率则呈递增趋势（x2=27.054，P=0.000＜0.05）。见表1。
2.2 p16和Ki67表达与胃癌病理特征的关系
p16在胃癌组织中的总缺失率为53.33%，与淋巴结有无转移在统计学上差异显著（P＜0.05），与胃癌的Lauren分型、分化程度及浸润深度无显著相关性。Ki67在胃癌组织中的总阳性表达率为71.67%，这与张艳红等[2-3]，检测Ki67在胃癌组织中的总阳性表达率分别为73.40%和73.53%相一致，与胃癌的Lauren分型、浸润深度及淋巴结有无转移在统计学上差异显著（P＜0.05），和分化程度无显著相关性。见表2。
2.3 p16和Ki67蛋白表达在胃癌组织中的相关性
在胃癌组织中p16和Ki67的表达呈负相关性（P＜0.05）。见表3。
3 讨论
胃癌是一类恶性上皮肿瘤，胃癌在生物学和遗
表3 p16和Ki67蛋白表达在胃癌组织中的相关性
Ki67表达强度 n p16表达强度（n） x2 P
（-） （+） （++） （+++）
（-） 17 5 9 3 0 60.000 0.000＜0.05
（+） 29 16 11 2 0
（++） 9 6 2 1 0
（+++） 5 5 0 0 0
傳学上具有多样性，且病因学上也存在多种因素的改变，胃癌发生发展的特征是因为先天和后天的变化而影响了癌基因、肿瘤抑制基因和DNA的错配修复（MMR）是多阶段综合作用的复杂过程，而癌基因的激活和抑癌基因的失活在胃癌的发生中发挥了重用[4]。p16基因定位于人第9号染色体21区域，该蛋白由148个氨基酸构成，分子量为15.8kDa，作用在细胞周期过程中，使细胞周期运行与环境和发育相一致，编码一种细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）的抑制蛋白，其表达产物p16蛋白为细胞周期负调控蛋白，通过抑制细胞素Dl与CDK4结合，从而阻止Rb蛋白磷酸化，最终使细胞停滞于G0期或G1期，而抑制细胞分裂、增殖。p16基因变异主要有纯合缺失、DNA异常甲基化、点突变、杂合缺失等。这些变化均可引起p16转录失活。p16基因表达减低有可能使癌细胞获得某种生长优势，这与各种肿瘤细胞系中存在p16基因表达减低而具有生长优势的结果一致[5]。也与近年研究一致[6-7]。
本研究发现，p16蛋白在胃癌中的表达减低，表明p16基因可能参与了胃癌的发生发展[8]。应用免疫组织化学SP法对胃组织中p16蛋白表达情况进行研究，结果显示其胃炎组织中阳性表达率为90.90%，这与部分学者检测胃正常黏膜p16阳性表达分别为90.48%[9]、85.00%[10]相一致，在轻度不典型增生组织中表达阳性率88.46%、中度不典型增生组织中表达阳性率86.67%及重度不典型增生组织中表达阳性率83.33%依次减弱，胃癌组织表达阳性率46.67%最低，这与孙桂彬等[9]检测胃癌组织中的p16结果相似，可见从胃炎黏膜上皮—不典型增生—胃癌的发展过程中p16的表达丢失逐渐积累（P＜0.01），说明p16蛋白表达异常降低主要开始于癌前病变和胃癌早期，不典型增生中已经存在p16蛋白的表达异常，不典型增生可能是胃黏膜组织癌变的中间阶段，p16阴性表达在胃癌恶性转化和癌变过程中发挥重要作用。本研究结果显示，p16的表达与胃癌的Lauren分型、浸润深度及分化程度无关（P＞0.05），与淋巴结转移有关（P＜0.05），这与异常甲基化是p16基因失活的主要原因，p16基因甲基化状态改变通常在组织恶变之前发生，有淋巴结转移的胃癌组织中p16基因甲基化阳性率与无转移组的有显著性差异[11]相一致，这也与张修稳等[12]研究的胃癌中p16在有淋巴结转移与无淋巴结转移对比中有显著差异相一致。因此，用免疫组化法检测p16蛋白表达的异常是诊断胃癌及其癌前病变的可靠生物学标志，也是判断胃癌患者预后的指标。Ki67在胃癌的发生发展过程中起到了重要的作用[13]，Ki67是一种细胞周期相关蛋白，不与CDK结合，而作为DNA聚合酶的附属蛋白，促进DNA聚合酶延伸DNA，在S期浓度最高，常作为S期标志物之一。
[关键词] 胃炎；不典型增生；胃癌；Ki67；p16
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）09-32-05
Exploration of expression of Ki67 and pl6 in gastric cancer and their correlation
JIA Zhenjun MIAO Xindong ZANG Xueliang GUO Xuejie
Department of Pathology,Shandong Aluminum Company Hospital,Zibo 255069,China
[Abstract] Objective To analyze the expression situation of Ki67 and p16 in gastritis tissue, dysplasia tissue and cancer tissue and explore their relationship to gastric tissue canceration and their possibility of being biological markers of early canceration. Methods The immunohistochemical SP method was used to detect the expression situation of Ki67 and p16 in 22 cases of gastritis tissue,80 cases of dysplasia tissue and 60 cases of cancer tissue. Results In gastritis tissue, dysplasia tissue and cancer tissue,Ki67 presented an ascending trend and the positive expression rate of p16 presented a descending trend.The results showed that the positive expression rates of Ki67 and p16 and the gastric mucosal tissue were correlated to each other from gastric cancer to dysplasia and from dysplasia to canceration(P＜0.05).The expression of Ki67 was correlated to the Lauren typing,invasion depth and lymphatic metastasis of gastric cancer,but not correlated to the differentiation degree.The expression of p16 was correlated to the Lauren typing, differentiation degree and invasion depth of gastric cancer,but not correlated to the lymphatic metastasis. The expression of Ki67 and p16 in gastric cancer tissue were negatively correlated(P＜0.05). Conclusion The abnormal expression of Ki67 and p16 relates to the canceration process of gastric cancer and both may become the molecular markers of the early canceration of gastric tissue.
[Key words] Gastritis;Dysplasia;Gastric cancer;Ki67;p16
胃癌的發生和发展涉及许多肿瘤抑制基因和肿瘤相关基因[1]，增殖核抗原Ki67是与细胞周期密切相关的细胞增殖标记物，其增殖指数与许多肿瘤的分化程度、浸润转移及预后密切相关。p16既是正常细胞周期的有效调控者，又是抑制肿瘤生长的关键因子，该蛋白通过阻止Rb蛋白的磷酸化，而抑制细胞分裂、增殖。当p16蛋白不能正常表达时，可能是p16基因发生纯合缺失、DNA异常甲基化、点突变、杂合缺失，使细胞分裂、增殖失控而发生癌变。我们承担了慢性胃炎与胃癌及邻癌黏膜的对比研
究项目，目前正在大量搜集资料，本研究采用免疫组化SP法对22例胃炎、80例不典型增生及60例胃癌组织中的增殖核抗原Ki67和抑癌基因p16蛋白进行了回顾性检测，旨在探讨Ki67与p16蛋白在胃炎、不典型增生及胃癌中的表达变化并探讨其意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选用山东铝业公司医院病理科2010年12月～2013年12月的胃镜活检组织102例，胃癌手术切除标本60例。男103例，女59例；平均年龄53.4岁。标本分为：（1）胃炎组织22例；（2）胃不典型增生组织80例；（3）胃癌组织60例；组织类型包括肠型（高分化腺癌、中分化腺癌）20例和弥漫型（低分化腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌、未分化癌）40例。
1.2 方法
所有标本均经10%中性福尔马林液固定，3μm连续切片，分别作HE和免疫组织化学染色。常规HE染色，观察胃癌的病理形态、浸润深度、脉管浸润、淋巴结转移等。单克隆抗体Ki67、p16及PV9000检测试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，免疫组织化学染色采用SP法。切片脱蜡至水，柠檬酸（pH6.0）高压蒸汽修复100℃、5min，PBS冲洗2min×3次；3%H2O2去离子水孵育室温15min，PBS冲洗2min×3次；滴加一抗Ki67和p16室温或37℃孵育1~2h或4℃冰箱过夜，PBS冲洗2min×3次；滴加通用型IgG抗体-HRP多聚体，室温或37℃孵育15min，PBS冲洗2min×3次；DAB显色，在显微镜下观察终止显色；复染，中性树胶封片，光学显微镜下观察。每批染色均设立阳性、阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 免疫组化结果判读
Ki67细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞。p16蛋白阳性定位主要在细胞核，也可在细胞质，细胞核或细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。取3个高倍镜视野中阳性细胞所占的细胞百分比的平均值，根据阳性肿瘤细胞占全部肿瘤细胞的比例将其分为：（１）阳性细胞数＜10%为阴性（—）；（２）阳性细胞数占10%～25%为（+）；（３）阳性细胞占25%～50%为（++）；（４）阳性细胞＞50%为（+++）。
图1 Ki67在胃炎组织的表达（40×10）
图2 Ki67 在胃不典型增生组织的表达（40×10）
图3 Ki67 在胃癌组织的表达（40×10）
图4 p16在胃炎组织的表达（40×10）
图5 p16 在胃肠化生组织的表达（40×10）
表1 胃炎组织、不典型增生组织和癌组织中Ki67与pl6的表达
组别 n Ki67表达强度（例） Ki67表达阳性率
（%） p16表达强度（例） p16表达阳性率
（%）
（-） （+） （++） （+++） （-） （+） （++） （+++）
胃炎组织 22 16 4 2 0 27.27 2 14 4 2 90.90
不典型增生 80 49 15 12 4 38.75 10 47 20 2 86.25
轻 26 18 4 4 0 30.77 2 14 8 1 88.46
中 30 20 5 4 1 33.33 4 17 8 1 86.67
重 24 11 6 4 3 54.17 4 16 4 0 83.33
胃癌组 60 17 27 9 5 71.67 32 22 6 0 46.67
表2 p16和Ki67表达与胃癌病理特征的关系
病理特征 n p16 ki67
缺失率[%（n）] x2 P 阳性率[%（n）] x2 P
Lauren分型 0.134 0.714＞0.05 10.506 0.001＜0.05
肠型 20 50.00（10） 45.00（9）
弥漫性 40 55.00（22） 85.00（34）
分化程度 3.839 0.147＞0.05 68.18（15） 1.037 0.595＞0.05
高 18 38.89（7） 66.67（12）
中 22 50.00（11） 68.18（15）
低 20 70.00（14） 80.00（16）
浸润深度 0.834 0.361＞0.05 17.709 0.000＜0.05
浆膜内 25 48.00（25） 68.00（17）
浆膜及浆膜外 35 57.14（20） 74.28（26）
淋巴结转移 5.757 0.016＜0.05 5.180 0.023＜0.05
无 25 44.00（11） 56.00（14）
有 35 60.00（21） 82.86（29）
图6 p16 在胃癌组织的表达（40×10）
1.4 统计学处理
采用SPSS17.0统计软件包进行数据处理，行x2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 胃炎组织、不典型增生组织和癌组织中Ki67与pl6的表达情况
在胃炎中p16主要表达在固有腺体的细胞核和胞浆中，而Ki67则以腺体颈细胞核为主，从不典型增生开始分布失去规律。胃炎组织→胃不典型增生组织→胃癌组织中p16表达阳性率呈递减趋势（x2=19.840，P=0.000＜0.05），Ki67的表达阳性率则呈递增趋势（x2=27.054，P=0.000＜0.05）。见表1。
2.2 p16和Ki67表达与胃癌病理特征的关系
p16在胃癌组织中的总缺失率为53.33%，与淋巴结有无转移在统计学上差异显著（P＜0.05），与胃癌的Lauren分型、分化程度及浸润深度无显著相关性。Ki67在胃癌组织中的总阳性表达率为71.67%，这与张艳红等[2-3]，检测Ki67在胃癌组织中的总阳性表达率分别为73.40%和73.53%相一致，与胃癌的Lauren分型、浸润深度及淋巴结有无转移在统计学上差异显著（P＜0.05），和分化程度无显著相关性。见表2。
2.3 p16和Ki67蛋白表达在胃癌组织中的相关性
在胃癌组织中p16和Ki67的表达呈负相关性（P＜0.05）。见表3。
3 讨论
胃癌是一类恶性上皮肿瘤，胃癌在生物学和遗
表3 p16和Ki67蛋白表达在胃癌组织中的相关性
Ki67表达强度 n p16表达强度（n） x2 P
（-） （+） （++） （+++）
（-） 17 5 9 3 0 60.000 0.000＜0.05
（+） 29 16 11 2 0
（++） 9 6 2 1 0
（+++） 5 5 0 0 0
傳学上具有多样性，且病因学上也存在多种因素的改变，胃癌发生发展的特征是因为先天和后天的变化而影响了癌基因、肿瘤抑制基因和DNA的错配修复（MMR）是多阶段综合作用的复杂过程，而癌基因的激活和抑癌基因的失活在胃癌的发生中发挥了重用[4]。p16基因定位于人第9号染色体21区域，该蛋白由148个氨基酸构成，分子量为15.8kDa，作用在细胞周期过程中，使细胞周期运行与环境和发育相一致，编码一种细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）的抑制蛋白，其表达产物p16蛋白为细胞周期负调控蛋白，通过抑制细胞素Dl与CDK4结合，从而阻止Rb蛋白磷酸化，最终使细胞停滞于G0期或G1期，而抑制细胞分裂、增殖。p16基因变异主要有纯合缺失、DNA异常甲基化、点突变、杂合缺失等。这些变化均可引起p16转录失活。p16基因表达减低有可能使癌细胞获得某种生长优势，这与各种肿瘤细胞系中存在p16基因表达减低而具有生长优势的结果一致[5]。也与近年研究一致[6-7]。
本研究发现，p16蛋白在胃癌中的表达减低，表明p16基因可能参与了胃癌的发生发展[8]。应用免疫组织化学SP法对胃组织中p16蛋白表达情况进行研究，结果显示其胃炎组织中阳性表达率为90.90%，这与部分学者检测胃正常黏膜p16阳性表达分别为90.48%[9]、85.00%[10]相一致，在轻度不典型增生组织中表达阳性率88.46%、中度不典型增生组织中表达阳性率86.67%及重度不典型增生组织中表达阳性率83.33%依次减弱，胃癌组织表达阳性率46.67%最低，这与孙桂彬等[9]检测胃癌组织中的p16结果相似，可见从胃炎黏膜上皮—不典型增生—胃癌的发展过程中p16的表达丢失逐渐积累（P＜0.01），说明p16蛋白表达异常降低主要开始于癌前病变和胃癌早期，不典型增生中已经存在p16蛋白的表达异常，不典型增生可能是胃黏膜组织癌变的中间阶段，p16阴性表达在胃癌恶性转化和癌变过程中发挥重要作用。本研究结果显示，p16的表达与胃癌的Lauren分型、浸润深度及分化程度无关（P＞0.05），与淋巴结转移有关（P＜0.05），这与异常甲基化是p16基因失活的主要原因，p16基因甲基化状态改变通常在组织恶变之前发生，有淋巴结转移的胃癌组织中p16基因甲基化阳性率与无转移组的有显著性差异[11]相一致，这也与张修稳等[12]研究的胃癌中p16在有淋巴结转移与无淋巴结转移对比中有显著差异相一致。因此，用免疫组化法检测p16蛋白表达的异常是诊断胃癌及其癌前病变的可靠生物学标志，也是判断胃癌患者预后的指标。Ki67在胃癌的发生发展过程中起到了重要的作用[13]，Ki67是一种细胞周期相关蛋白，不与CDK结合，而作为DNA聚合酶的附属蛋白，促进DNA聚合酶延伸DNA，在S期浓度最高，常作为S期标志物之一。