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摘要阿奇霉素(azithromycin)为15元环的半合成大环内酯类抗生素,化学结构是在红霉素的基础上加以改进,在其A酯环的9α位插入一个取代甲基的氮原子,弥补红霉素的结构缺陷,进而改善其药理学性能。主要探讨阿奇霉素在肉鸡中的亚急性毒性、残留检测及药代动力学的消除规律。我们以麻花肉鸡为实验对象,通过测定其血清的生化指标及脏器系数,并进行组织病理学观察来探索阿奇霉素的亚急性毒性;将阿奇霉素以10mg/kg体重的剂量对肉鸡连续灌服7天,然后采用HPLC—紫外法对体内各器官组织进行残留检测;通过对色谱条件的优化、标准曲线的建立及样品测定来研究其药代动力学的消除规律。
关键词阿奇霉素;禽体;毒性;残留检测;药代动力学
中图分类号R9文献标识码A文章编号1673-9671-(2010)052-0114-01
阿奇霉素为15元环半合成氮杂内酯类的第一个制剂,在化学结构上对红霉素进行了修饰和优化,既保持了对革兰氏阳性菌的抗菌活性,又提高了对革兰氏阴性菌的抗菌效果。其代谢物无活性,对大多数耐红霉素杆菌有良好的抗菌效果。但该抗生素也有一些潜在的问题,如细菌产生耐药性、残留时间长、蓄积毒性大等。我们以麻花肉鸡为实验对象,按照新兽药的临床试验要求,分析探索了阿奇霉素在肉鸡中的亚急性毒性、残留检测及药代动力学的消除规律,初步揭示了阿奇霉素在家禽养殖中的应用前景。
1材料
1.1药品与试剂
阿奇霉素(475IU/mg,20080312,石家庄制药集团华盛制药有限公司);阿奇霉素标准品(946IU/mg,20051211,中国药品生物制品检定所);阿奇霉素对照品(1000IU/mg,200609101,金华市奥奇生物化学有限公司);丙氨酸氨基转移酶试剂盒(ALT,紫外-乳酸脱氢酶法,上海科华东菱诊断用品有限公司);门冬氨酸氨基转移酶试剂盒(AST,连续监测法,上海申索佑福医学诊断用品有限公司)。乙腈、甲醇(色谱纯,上海德正化工有限公司),其余试剂均为分析纯级别。
1.2仪器
高效液相色谱仪,大连依利特分析仪器有限公司,型号P1201(UV1201紫外-可见检测器、P1201高压恒流泵、EC2006色谱数据处理工作站);显微摄像仪,型号BX50,日本奥林巴斯公司;离心机,型号3K15,德国SIGMA公司;电子天平,型号AB265-S,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;752紫外分光光度计,型号HP289532,美国惠普公司。
1.3饲料
饲料参照美国国家研究委员会(NRC,1994)营养标准配制加工而成。试验期间试验鸡自由采食全价料,以玉米、豆粕为主。
2亚急性毒性试验
选用20日龄的健康麻花肉鸡80只,试验前先置于实验动物房笼养适应3天。按照雌雄各半的组成比例,将这80只麻花鸡随机分为一个对照组和三个试验组,每组20只并分笼饲养。对照组给予的饮水为纯净水;试验组在饮水中分别按照0、60、120和240mg/L的剂量加入水溶性阿奇霉素,供试验鸡自由饮用。测定各组的血清学指标及生化指标和肝脏系数,并且进行病理学观察,从而对阿奇霉素的亚急性毒性进行评价。
2.1血清采集及生化指标的测定
給药期间,每日观察各组鸡的精神状态和食欲情况,并且详细记录采食量、饮水量。待12天的试验期结束,将试验鸡颈静脉放血,取中段血2mL。血液凝固后以3000r/min的速度离心10min,分离出血清,依照试剂盒说明书上载明的方法,分别采用紫外-乳酸脱氢酶法和连续监测法对丙氨酸氨基转移酶(ALT)和门冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性进行测定。
试验结果:基于80份样品的测定结果及统计软件的分析,结果表明,低剂量阿奇霉素对鸡ALT和AST活性的影响没有显著的差异;但中、高剂量组的ALT活性与对照组存在明显的差异。
2.2脏器系数测定及组织病理学观察
将试验鸡放血处死,迅速进行解剖并取出心脏、肝、脾、肾等内脏器官,除去其上附着的脂肪和筋膜,称重,然后经计算得出各脏器的脏器系数(脏器系数=脏器重量/体重×100%)。称重后的脏器,经固定液固定24小时,脱水后石蜡包埋,切片并进行HE染色,显微镜下观察。
试验结果:低剂量组及中剂量组的鸡脏器无明显眼观病变,高剂量组鸡肝表面出现黄斑、肿大、出血点;关于脏器系数,中、低剂量组与对照组无显著性差异,而高剂量组的鸡出现肝的脏器系数显著增大。
3残留检测
阿奇霉素在波长210nm处有较强的吸收,适合用反相高效液相色谱法来分析,这也是目前国际上认可度比较高的检测方法,已被许多国家的权威检测机构采用。我们的研究表明,运用反相高效液相色谱法可以得到的最低检出量为0.05μg/mL,这比国外报道的另一种常用的检测方法—微生物法所能得到的最低检出量0.074μg/mL略低,同时也显著低于国内关于最大残留量的地方和行业标准。
4药代动力学的消除规律研究
选用50日龄的健康麻花肉鸡80只,组成比例雌雄各半。采样前10天饲喂不含抗生素的饲料。给药前采一次空白样品作为对照,试验过程中在每次喂食前两小时以灌服的方式给药。按10mg/kg体重的剂量连续灌服阿奇霉素7天,每天3次。分别在停药后的3小时、12小时、1天、3天、5天、7天、9天和11天采血,取5mL全血于离心管中,静置凝固后以4000r/min的速度离心得到血清。处死并取10g胸肌、肝、肾和脾,去除筋膜和脂肪,经0.85%生理盐水冲洗后置于-20℃冰箱存放备用。
4.1色谱条件
依据仪器的使用说明和我们的多次探索优化,设定色谱条件为:色谱柱为C18柱;柱温为30℃;紫外检测波长为210nm;流动相的体积比乙腈:异丙醇:0.002mol/L磷酸氢二钠溶液=55:25:20;流速1mL/min;进样量为40μL。
4.2标准曲线的建立
取4g空白对照样品,剪碎后加入磷酸盐缓冲液8mL,匀浆制成空白对照匀浆组织液,操作过程中要注意避免污染。取3g匀浆组织液于10mL离心管中,加入阿奇霉素标准液并梯度稀释。震荡1min,加入磷酸盐缓冲液和氢氧化钠溶液,震荡5min。加入氯仿(含5%异丙醇)5mL,以6000r/min的速度离心5min,取有机层2mL,氮气吹干,加入配制好的流动相100μL,以6000r/min的速度离心10min。过滤上清液,经超声30min后取40μL进行反相高效液相色谱分析。以峰面积对浓度做标准曲线。
4.3样品测定
取血清样品0.3mL于10mL离心管中,加入双蒸水0.2mL,按标准曲线的建立方法继续操作。根据峰面积的数值,在标准曲线上查得样品中阿奇霉素的浓度。
4.4结果分析
试验表明,连续灌服阿奇霉素7天的麻花肉鸡,肝中的残留量最高,其次是肾、脾、肌肉,血清中的残留量最少。这与前人关于阿奇霉素的药代动力学的研究结果一致,并说明了在连续口服给药后,阿奇霉素可以在肝肾中产生高水平的蓄积,其消除速率与红霉素、罗红霉素等其它大环内酯类抗生素相比要慢许多。
我们发现,在停药4天以内,机体中阿奇霉素的浓度水平相对较高,代谢消除速度较快;从停药第4天开始,机体组织器官中的浓度降为中等水平并持续下降,代谢消除速度减慢,直到第12天才完全消除。这可能与阿奇霉素的血消除半衰期较长及在体液和组织中的广泛分布有关。
5结束语
阿奇霉素自1980年发现以来,做为一种效果确实的广谱抗生素,被广泛应用于人医的临床治疗。但是由于价格偏高,制约了其在兽医临床特别是规模化、集约化养殖业上的应用。阿奇霉素的专利保护期在2005年已经结束,国内厂家随即引进了一批生产线,产品价格有所下降,这对于我们一直致力于的目标—减少红霉素等副作用大、残留高的上一代抗生素的应用,推广其替代品阿奇霉素而言,无疑是一个好消息。本文以麻花肉鸡为实验对象,按照行业通用的新兽药临床试验要求,对肉鸡中阿奇霉素的亚急性毒性、残留检测方法及药代动力学的消除规律进行了探索和研究,初步阐明了阿奇霉素在肉鸡应用中的有效性和安全性,为保障动物源性食品的公共卫生安全提供了一定的理论依据,揭示了阿奇霉素在家禽养殖中的应用前景。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[S].北京:化学工业出版社,2000.
[2]沈建忠.动物毒理学[M].北京:中国农业出版社,2002.
关键词阿奇霉素;禽体;毒性;残留检测;药代动力学
中图分类号R9文献标识码A文章编号1673-9671-(2010)052-0114-01
阿奇霉素为15元环半合成氮杂内酯类的第一个制剂,在化学结构上对红霉素进行了修饰和优化,既保持了对革兰氏阳性菌的抗菌活性,又提高了对革兰氏阴性菌的抗菌效果。其代谢物无活性,对大多数耐红霉素杆菌有良好的抗菌效果。但该抗生素也有一些潜在的问题,如细菌产生耐药性、残留时间长、蓄积毒性大等。我们以麻花肉鸡为实验对象,按照新兽药的临床试验要求,分析探索了阿奇霉素在肉鸡中的亚急性毒性、残留检测及药代动力学的消除规律,初步揭示了阿奇霉素在家禽养殖中的应用前景。
1材料
1.1药品与试剂
阿奇霉素(475IU/mg,20080312,石家庄制药集团华盛制药有限公司);阿奇霉素标准品(946IU/mg,20051211,中国药品生物制品检定所);阿奇霉素对照品(1000IU/mg,200609101,金华市奥奇生物化学有限公司);丙氨酸氨基转移酶试剂盒(ALT,紫外-乳酸脱氢酶法,上海科华东菱诊断用品有限公司);门冬氨酸氨基转移酶试剂盒(AST,连续监测法,上海申索佑福医学诊断用品有限公司)。乙腈、甲醇(色谱纯,上海德正化工有限公司),其余试剂均为分析纯级别。
1.2仪器
高效液相色谱仪,大连依利特分析仪器有限公司,型号P1201(UV1201紫外-可见检测器、P1201高压恒流泵、EC2006色谱数据处理工作站);显微摄像仪,型号BX50,日本奥林巴斯公司;离心机,型号3K15,德国SIGMA公司;电子天平,型号AB265-S,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;752紫外分光光度计,型号HP289532,美国惠普公司。
1.3饲料
饲料参照美国国家研究委员会(NRC,1994)营养标准配制加工而成。试验期间试验鸡自由采食全价料,以玉米、豆粕为主。
2亚急性毒性试验
选用20日龄的健康麻花肉鸡80只,试验前先置于实验动物房笼养适应3天。按照雌雄各半的组成比例,将这80只麻花鸡随机分为一个对照组和三个试验组,每组20只并分笼饲养。对照组给予的饮水为纯净水;试验组在饮水中分别按照0、60、120和240mg/L的剂量加入水溶性阿奇霉素,供试验鸡自由饮用。测定各组的血清学指标及生化指标和肝脏系数,并且进行病理学观察,从而对阿奇霉素的亚急性毒性进行评价。
2.1血清采集及生化指标的测定
給药期间,每日观察各组鸡的精神状态和食欲情况,并且详细记录采食量、饮水量。待12天的试验期结束,将试验鸡颈静脉放血,取中段血2mL。血液凝固后以3000r/min的速度离心10min,分离出血清,依照试剂盒说明书上载明的方法,分别采用紫外-乳酸脱氢酶法和连续监测法对丙氨酸氨基转移酶(ALT)和门冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性进行测定。
试验结果:基于80份样品的测定结果及统计软件的分析,结果表明,低剂量阿奇霉素对鸡ALT和AST活性的影响没有显著的差异;但中、高剂量组的ALT活性与对照组存在明显的差异。
2.2脏器系数测定及组织病理学观察
将试验鸡放血处死,迅速进行解剖并取出心脏、肝、脾、肾等内脏器官,除去其上附着的脂肪和筋膜,称重,然后经计算得出各脏器的脏器系数(脏器系数=脏器重量/体重×100%)。称重后的脏器,经固定液固定24小时,脱水后石蜡包埋,切片并进行HE染色,显微镜下观察。
试验结果:低剂量组及中剂量组的鸡脏器无明显眼观病变,高剂量组鸡肝表面出现黄斑、肿大、出血点;关于脏器系数,中、低剂量组与对照组无显著性差异,而高剂量组的鸡出现肝的脏器系数显著增大。
3残留检测
阿奇霉素在波长210nm处有较强的吸收,适合用反相高效液相色谱法来分析,这也是目前国际上认可度比较高的检测方法,已被许多国家的权威检测机构采用。我们的研究表明,运用反相高效液相色谱法可以得到的最低检出量为0.05μg/mL,这比国外报道的另一种常用的检测方法—微生物法所能得到的最低检出量0.074μg/mL略低,同时也显著低于国内关于最大残留量的地方和行业标准。
4药代动力学的消除规律研究
选用50日龄的健康麻花肉鸡80只,组成比例雌雄各半。采样前10天饲喂不含抗生素的饲料。给药前采一次空白样品作为对照,试验过程中在每次喂食前两小时以灌服的方式给药。按10mg/kg体重的剂量连续灌服阿奇霉素7天,每天3次。分别在停药后的3小时、12小时、1天、3天、5天、7天、9天和11天采血,取5mL全血于离心管中,静置凝固后以4000r/min的速度离心得到血清。处死并取10g胸肌、肝、肾和脾,去除筋膜和脂肪,经0.85%生理盐水冲洗后置于-20℃冰箱存放备用。
4.1色谱条件
依据仪器的使用说明和我们的多次探索优化,设定色谱条件为:色谱柱为C18柱;柱温为30℃;紫外检测波长为210nm;流动相的体积比乙腈:异丙醇:0.002mol/L磷酸氢二钠溶液=55:25:20;流速1mL/min;进样量为40μL。
4.2标准曲线的建立
取4g空白对照样品,剪碎后加入磷酸盐缓冲液8mL,匀浆制成空白对照匀浆组织液,操作过程中要注意避免污染。取3g匀浆组织液于10mL离心管中,加入阿奇霉素标准液并梯度稀释。震荡1min,加入磷酸盐缓冲液和氢氧化钠溶液,震荡5min。加入氯仿(含5%异丙醇)5mL,以6000r/min的速度离心5min,取有机层2mL,氮气吹干,加入配制好的流动相100μL,以6000r/min的速度离心10min。过滤上清液,经超声30min后取40μL进行反相高效液相色谱分析。以峰面积对浓度做标准曲线。
4.3样品测定
取血清样品0.3mL于10mL离心管中,加入双蒸水0.2mL,按标准曲线的建立方法继续操作。根据峰面积的数值,在标准曲线上查得样品中阿奇霉素的浓度。
4.4结果分析
试验表明,连续灌服阿奇霉素7天的麻花肉鸡,肝中的残留量最高,其次是肾、脾、肌肉,血清中的残留量最少。这与前人关于阿奇霉素的药代动力学的研究结果一致,并说明了在连续口服给药后,阿奇霉素可以在肝肾中产生高水平的蓄积,其消除速率与红霉素、罗红霉素等其它大环内酯类抗生素相比要慢许多。
我们发现,在停药4天以内,机体中阿奇霉素的浓度水平相对较高,代谢消除速度较快;从停药第4天开始,机体组织器官中的浓度降为中等水平并持续下降,代谢消除速度减慢,直到第12天才完全消除。这可能与阿奇霉素的血消除半衰期较长及在体液和组织中的广泛分布有关。
5结束语
阿奇霉素自1980年发现以来,做为一种效果确实的广谱抗生素,被广泛应用于人医的临床治疗。但是由于价格偏高,制约了其在兽医临床特别是规模化、集约化养殖业上的应用。阿奇霉素的专利保护期在2005年已经结束,国内厂家随即引进了一批生产线,产品价格有所下降,这对于我们一直致力于的目标—减少红霉素等副作用大、残留高的上一代抗生素的应用,推广其替代品阿奇霉素而言,无疑是一个好消息。本文以麻花肉鸡为实验对象,按照行业通用的新兽药临床试验要求,对肉鸡中阿奇霉素的亚急性毒性、残留检测方法及药代动力学的消除规律进行了探索和研究,初步阐明了阿奇霉素在肉鸡应用中的有效性和安全性,为保障动物源性食品的公共卫生安全提供了一定的理论依据,揭示了阿奇霉素在家禽养殖中的应用前景。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[S].北京:化学工业出版社,2000.
[2]沈建忠.动物毒理学[M].北京:中国农业出版社,2002.