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【摘 要】 目的:观察大鼠全脑缺血-再灌流损伤后脑水肿及BB-94对其的影响。方法:采用Pulsinelli大鼠四血管阻塞模型,缺血15分钟后恢复血流,随机分为正常组、假手术组、再灌流生理盐水组及BB-94治疗组。按规定时间取脑,测定脑组织中脑水含量及EB含量。结果:脑缺血-再灌流损伤时,再灌注3h后脑水含量开始增高,到24、48h达到高峰,BB-94能在24、48h明显降低脑水含量,EB含量在灌注后3、48h处明显增高,BB-94在3、48h处明显降低其含量。结论:脑缺血-再灌流损伤导致脑水肿的发生,人工合成的基质金属蛋白酶抑制剂BB-94能减轻这种脑水肿程度,起脑保护作用,提供了一个新的治疗窗口。
【关键词】 脑缺血再灌流损伤 脑水肿 血脑屏障 BB-94 基质金属蛋白酶 抑制剂 大鼠
A study of the role of BB-94 on brain edema after cerebral ischemic reperfusion injury inrats
Tang youqing,et al
【Abstract】 Objective:To investigate the effect of BB-94 on brain edema after cerebral ischemic reperfusion injury in rats.Methods:The four-vessel occlusion model of Pulsinelli was sed and reperfusion was started at 15min after ischemia. The rat were randomly divided into 4 groups including Normal、Sham-operated、N.S. reperfusion and BB-94 reperfusion. After samples were taken from the brain on time, the water content and EB extravasation were observed.Results:The water content: there was no significant difference between normal group and sham-operated group; it increased gradually after 3 hours of reperfusion and was maximal at 48 hours in N.S. reperfusion. It was significantly lowered in BB-94 group at 24、48 hours. EB extravasation: there was no significant difference between normal group and sham-operated group; it increased at 3、48hours in N.S. reperfusion group. Only after 3 and 48 hours of reperfusion, BB-94 group was apparently lowered than N.S. reperfusion group.Conclusion:When cerebral ischemic reperfusion injury occurred, the water content and EB extravasation of brain tissue were increased. However, BB-94, a synthetic matrix metalloproteinase inhibitor, could decrease the degree of brain edema and extend the therapeutic window.
【Key words】 Cerebral ischemic reperfosion injury Brain edema Blood brain-barrier BB-94 Matrix metalloproteinases Tissue Inhibitor of Mettalloproteinases Rat
全脑缺血-再灌流损伤的直接结果是形成脑水肿,特点是以血管源性脑水肿为主的混合性脑水肿。本研究以Pulsinelli四血管闭塞法制成Wistar大鼠全脑缺血-再灌流损伤模型,干湿比法测定脑水含量,甲酰胺法测定伊文氏蓝(Evens Blue EB)含量,以了解脑水肿的程度和血脑屏障的损伤情况,探讨全脑缺血-再灌流损伤脑水肿发生的时间过程及脑水含量、EB含量的变化情况。在此基础上,施以外源性金属蛋白酶抑制剂BB-94进行治疗,观察其对脑水含量和EB含量的影响。将BB-94应用于全脑缺血-再灌流损伤后脑保护机制的研究,在国内尚属首次报道。
1 材料与方法
1.1 全脑缺血,再灌流损伤模型制作。清洁级Wistar雄性大鼠180只,体重200~250g,由第一军医大学动物中心提供。参照改良的Pulsinelli四血管闭塞法制作全脑缺血模型[1]。假手术组不电凝椎动脉和不夹闭颈总动脉。BB-94治疗组是以BB-94(Batimastat,人工合成化合物,为外源性金属蛋白酶抑制剂,由British Biotechnology提供)30mg/Kg在缺血完成后10分钟腹腔注射,缺血-再灌流2h后等剂量重复注射1次(3h组除外)[2]。脑缺血生理盐水组是以生理盐水注射作为对照。
1.2 动物分组。随机分为4组:正常对照组,假手术组,脑缺血生理盐水组,BB-94治疗组。除正常对照组外,各组又选取不同时间点,测定脑水含量时,观察缺血-再灌流后3、24、48、72、120、168h;测定EB含量时,观察缺血-再灌流后3、6、15、24、48、120、168h。每组标本均为6只大鼠。
1.3 脑水含量测定(干湿比法)。麻醉大鼠后断头取左侧大脑半球前1/3全层脑组织标本,电子分析天平称湿重后放入电热恒温烤箱内烘烤48h,至恒重后称干重,根据Ellit公式,计算出各组不同时间段的脑组织含水量。
1.4 脑组织伊文氏蓝(EB)含量测定。标准曲线制作:称取4mg EB加生理盐水至总容积为25ml,取0.3ml加入5.7ml甲酰胺中混匀作为第1管,从第1管中取3ml加入3ml甲酰胺中作为第2管,依次类推共作6管,水浴孵育后比色,制作出标准曲线。动物处死前从舌静脉注射伊文氏蓝,断头后取脑组织,称重后置入存有甲酰胺的试管中,水浴后比色测定其光密度值,根据标准曲线,计算出EB含量。
1.5 统计学处理。测定值用均数±标准差(x±s)表示,结果用SSPS8.0软件中单因素方差分析(One-way ANOVA)和各组均数t检验处理。P<0.05为显著差异。
2 结 果
2.1 脑水含量测定。假手术组与正常对照组比较无明显差异,脑缺血生理盐水组在灌注3h后脑水含量开始增高,到24、48h达到高峰;BB-94治疗组脑水含量在24、48h处明显低于脑缺血生理盐水组,在3h处无显著差异。结果见表Ⅰ。
表 Ⅰ 脑缺血再灌流后各组脑水含量(WC)测定
2.2 EB含量测定。假手术组与正常对照组比较无明显差别,脑缺血生理盐水组在3、48h处较正常组明显增高,其余6、15、24、120、168h处虽较正常组高但无显著意义;BB-94治疗组较生理盐水组仅在3、48h处明显降低,其余各时间点上均无显著差异。结果见表Ⅱ。
表 Ⅱ 脑缺血再灌流后各组伊文氏蓝(EB)含量测定
3 讨 论
本实验采用电凝Wistar大鼠2条椎动脉,分离并以动脉夹夹闭/开放两侧颈动脉制成全脑缺血-再灌流模型。系改良的Pulsinelli四血管闭塞法[1],具备受麻醉剂影响小,缺血可靠,重复性好,手术副损伤小的优点。观察结果可靠,是研究全脑缺血-再灌流损伤的病理生理机制的理想动物模型。
以干湿比法测定脑水含量,甲酰胺法测定EB含量,观察脑水肿的程度和血脑屏障(Blood-brain barrie BBB)的损伤情况,是国内外比较经典实用的实验方法。实验中发现全脑缺血再灌流损伤后脑缺血生理盐水组脑水含量在灌注3h后开始增高,到24、48h达到高峰。EB含量测定在3、48h处较正常组明显增高。BB-94治疗组脑水含量在24、48h处明显低于脑缺血生理盐水组,EB含量测定在3、48h处明显降低。表明BB-94能抑制血脑屏障(BBB)的开放和减轻脑水肿的程度,起脑保护作用。
BB-94是外源性人工合成的基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases MMPs)抑制剂[2],从化学结构分析BB-94是一种广泛的金属蛋白酶抑制物(Tissue inhibitors to metalloproteinase TIMPs),能抑制MMP-9、MMP-2的活性。而MMP-9、MMP-2是基质金属蛋白酶(MMP)家族的2个成员,均可降解血脑屏障(Blood-brain barrier BBB)上基底膜的细胞外基质(ExtracellularmatrixECM)成分,其底物包括4型、5型胶原酶、纤维连接蛋白、弹性蛋白和变性的基质胶原[3]。一般认为BBB上的紧密连接开放是导致血管源性脑水肿(Vasogenic Brain Edema VBE)发生的主要因素[4]。但超微结构的研究发现BBB的完整结构应包含血管内皮细胞及其紧密连接、基底膜和胶质细胞的足突[5]。因此,基底膜和胶质细胞足突的结构和功能破坏理应参与了BBB通透性改变的过程。据此可以设想,当全脑缺血-再灌流损伤发生时,可能存在有MMP-9、MMP-2对基底膜的过度分解破坏,使血脑屏障通透性增高,促使脑水肿的形成。而施以BB-94则能明显抑制这种作用的发生。在实验中观察到BBB开放仅处于缺血后3、48h,这是否是MMP-9、MMP-2两酶的不同作用方式的结果尚需要进一步的证实和研究。但将基质金属蛋白酶和其外源性人工合成抑制剂(BB-94)引入神经科学领域研究,无疑将具有重要的创新价值。
参考文献
1 Pulsinelli WA,et al.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat.Stroke,1979;10
2 Rosenberg GA,et al.Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain.Stoke,1998;29:2189~2195
3 Romanic AM,et al.Matrix metalloproteinase expression increase after cerebral focal ischemia in rats.Inhibition of matrix metalloproteinase-9 reduces infarct size.Stroke,1998;29:1020~1030
4 Schilling L,et al.Brain edema:pathogenesis and therapy.Kidney int- Suppl,1997;59:S69~S75
5 Oury TD,et al.Cold-induced brain edema in mice involvement of extracellular superoide dismutase and nitric oxide.J B iol Chem,1993;268:14349~15398
【关键词】 脑缺血再灌流损伤 脑水肿 血脑屏障 BB-94 基质金属蛋白酶 抑制剂 大鼠
A study of the role of BB-94 on brain edema after cerebral ischemic reperfusion injury inrats
Tang youqing,et al
【Abstract】 Objective:To investigate the effect of BB-94 on brain edema after cerebral ischemic reperfusion injury in rats.Methods:The four-vessel occlusion model of Pulsinelli was sed and reperfusion was started at 15min after ischemia. The rat were randomly divided into 4 groups including Normal、Sham-operated、N.S. reperfusion and BB-94 reperfusion. After samples were taken from the brain on time, the water content and EB extravasation were observed.Results:The water content: there was no significant difference between normal group and sham-operated group; it increased gradually after 3 hours of reperfusion and was maximal at 48 hours in N.S. reperfusion. It was significantly lowered in BB-94 group at 24、48 hours. EB extravasation: there was no significant difference between normal group and sham-operated group; it increased at 3、48hours in N.S. reperfusion group. Only after 3 and 48 hours of reperfusion, BB-94 group was apparently lowered than N.S. reperfusion group.Conclusion:When cerebral ischemic reperfusion injury occurred, the water content and EB extravasation of brain tissue were increased. However, BB-94, a synthetic matrix metalloproteinase inhibitor, could decrease the degree of brain edema and extend the therapeutic window.
【Key words】 Cerebral ischemic reperfosion injury Brain edema Blood brain-barrier BB-94 Matrix metalloproteinases Tissue Inhibitor of Mettalloproteinases Rat
全脑缺血-再灌流损伤的直接结果是形成脑水肿,特点是以血管源性脑水肿为主的混合性脑水肿。本研究以Pulsinelli四血管闭塞法制成Wistar大鼠全脑缺血-再灌流损伤模型,干湿比法测定脑水含量,甲酰胺法测定伊文氏蓝(Evens Blue EB)含量,以了解脑水肿的程度和血脑屏障的损伤情况,探讨全脑缺血-再灌流损伤脑水肿发生的时间过程及脑水含量、EB含量的变化情况。在此基础上,施以外源性金属蛋白酶抑制剂BB-94进行治疗,观察其对脑水含量和EB含量的影响。将BB-94应用于全脑缺血-再灌流损伤后脑保护机制的研究,在国内尚属首次报道。
1 材料与方法
1.1 全脑缺血,再灌流损伤模型制作。清洁级Wistar雄性大鼠180只,体重200~250g,由第一军医大学动物中心提供。参照改良的Pulsinelli四血管闭塞法制作全脑缺血模型[1]。假手术组不电凝椎动脉和不夹闭颈总动脉。BB-94治疗组是以BB-94(Batimastat,人工合成化合物,为外源性金属蛋白酶抑制剂,由British Biotechnology提供)30mg/Kg在缺血完成后10分钟腹腔注射,缺血-再灌流2h后等剂量重复注射1次(3h组除外)[2]。脑缺血生理盐水组是以生理盐水注射作为对照。
1.2 动物分组。随机分为4组:正常对照组,假手术组,脑缺血生理盐水组,BB-94治疗组。除正常对照组外,各组又选取不同时间点,测定脑水含量时,观察缺血-再灌流后3、24、48、72、120、168h;测定EB含量时,观察缺血-再灌流后3、6、15、24、48、120、168h。每组标本均为6只大鼠。
1.3 脑水含量测定(干湿比法)。麻醉大鼠后断头取左侧大脑半球前1/3全层脑组织标本,电子分析天平称湿重后放入电热恒温烤箱内烘烤48h,至恒重后称干重,根据Ellit公式,计算出各组不同时间段的脑组织含水量。
1.4 脑组织伊文氏蓝(EB)含量测定。标准曲线制作:称取4mg EB加生理盐水至总容积为25ml,取0.3ml加入5.7ml甲酰胺中混匀作为第1管,从第1管中取3ml加入3ml甲酰胺中作为第2管,依次类推共作6管,水浴孵育后比色,制作出标准曲线。动物处死前从舌静脉注射伊文氏蓝,断头后取脑组织,称重后置入存有甲酰胺的试管中,水浴后比色测定其光密度值,根据标准曲线,计算出EB含量。
1.5 统计学处理。测定值用均数±标准差(x±s)表示,结果用SSPS8.0软件中单因素方差分析(One-way ANOVA)和各组均数t检验处理。P<0.05为显著差异。
2 结 果
2.1 脑水含量测定。假手术组与正常对照组比较无明显差异,脑缺血生理盐水组在灌注3h后脑水含量开始增高,到24、48h达到高峰;BB-94治疗组脑水含量在24、48h处明显低于脑缺血生理盐水组,在3h处无显著差异。结果见表Ⅰ。
表 Ⅰ 脑缺血再灌流后各组脑水含量(WC)测定
2.2 EB含量测定。假手术组与正常对照组比较无明显差别,脑缺血生理盐水组在3、48h处较正常组明显增高,其余6、15、24、120、168h处虽较正常组高但无显著意义;BB-94治疗组较生理盐水组仅在3、48h处明显降低,其余各时间点上均无显著差异。结果见表Ⅱ。
表 Ⅱ 脑缺血再灌流后各组伊文氏蓝(EB)含量测定
3 讨 论
本实验采用电凝Wistar大鼠2条椎动脉,分离并以动脉夹夹闭/开放两侧颈动脉制成全脑缺血-再灌流模型。系改良的Pulsinelli四血管闭塞法[1],具备受麻醉剂影响小,缺血可靠,重复性好,手术副损伤小的优点。观察结果可靠,是研究全脑缺血-再灌流损伤的病理生理机制的理想动物模型。
以干湿比法测定脑水含量,甲酰胺法测定EB含量,观察脑水肿的程度和血脑屏障(Blood-brain barrie BBB)的损伤情况,是国内外比较经典实用的实验方法。实验中发现全脑缺血再灌流损伤后脑缺血生理盐水组脑水含量在灌注3h后开始增高,到24、48h达到高峰。EB含量测定在3、48h处较正常组明显增高。BB-94治疗组脑水含量在24、48h处明显低于脑缺血生理盐水组,EB含量测定在3、48h处明显降低。表明BB-94能抑制血脑屏障(BBB)的开放和减轻脑水肿的程度,起脑保护作用。
BB-94是外源性人工合成的基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases MMPs)抑制剂[2],从化学结构分析BB-94是一种广泛的金属蛋白酶抑制物(Tissue inhibitors to metalloproteinase TIMPs),能抑制MMP-9、MMP-2的活性。而MMP-9、MMP-2是基质金属蛋白酶(MMP)家族的2个成员,均可降解血脑屏障(Blood-brain barrier BBB)上基底膜的细胞外基质(ExtracellularmatrixECM)成分,其底物包括4型、5型胶原酶、纤维连接蛋白、弹性蛋白和变性的基质胶原[3]。一般认为BBB上的紧密连接开放是导致血管源性脑水肿(Vasogenic Brain Edema VBE)发生的主要因素[4]。但超微结构的研究发现BBB的完整结构应包含血管内皮细胞及其紧密连接、基底膜和胶质细胞的足突[5]。因此,基底膜和胶质细胞足突的结构和功能破坏理应参与了BBB通透性改变的过程。据此可以设想,当全脑缺血-再灌流损伤发生时,可能存在有MMP-9、MMP-2对基底膜的过度分解破坏,使血脑屏障通透性增高,促使脑水肿的形成。而施以BB-94则能明显抑制这种作用的发生。在实验中观察到BBB开放仅处于缺血后3、48h,这是否是MMP-9、MMP-2两酶的不同作用方式的结果尚需要进一步的证实和研究。但将基质金属蛋白酶和其外源性人工合成抑制剂(BB-94)引入神经科学领域研究,无疑将具有重要的创新价值。
参考文献
1 Pulsinelli WA,et al.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat.Stroke,1979;10
2 Rosenberg GA,et al.Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain.Stoke,1998;29:2189~2195
3 Romanic AM,et al.Matrix metalloproteinase expression increase after cerebral focal ischemia in rats.Inhibition of matrix metalloproteinase-9 reduces infarct size.Stroke,1998;29:1020~1030
4 Schilling L,et al.Brain edema:pathogenesis and therapy.Kidney int- Suppl,1997;59:S69~S75
5 Oury TD,et al.Cold-induced brain edema in mice involvement of extracellular superoide dismutase and nitric oxide.J B iol Chem,1993;268:14349~15398