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【摘 要】 目的:在对HBsAg疫苗进行长期毒性试验时,连续给予超高剂量基因重组的HBsAg疫苗后,在检测其安全性的同时观察小鼠产生IgG及其亚类抗-HBs的动态。方法:给药剂量为600μg/kg(约为人临床拟用量的600倍),每天给药一次,连续21天,末次免疫后一个月,用ELISA法检测小鼠血清中IgG及亚类(IgG1、IgG2a)抗HBs抗体。结果:超高剂量HBsAg疫苗仍可刺激机体在3周和7周产生高水平IgG和IgG1类抗-HBs,但IgG2a类抗-HBs出现较迟,在免疫3周后未曾检出,到末次接种一月后方可测出,且水平较低。结论:超高剂量乙肝疫苗对机体免疫系统无毒性作用,早期可刺激机体产生高水平IgG1类特异性抗体,后期出现与细胞免疫相关的(IgG2a)类特异性抗体,其抗体产生的规律与高剂量(60μg/kg)疫苗基本一致。
【关键词】 乙肝HBsAg疫苗 抗-HBs-IgG IgG1 IgG2a
Effect of Superhigh Dose hepatitis B surface antigen Vaccine on the specific antibody induced in mice
Liu Guangze,et al
【Abstract】 Objective:To study the safe and the specific immune responses of anti-HBs-IgG and subclass in mice, after serial Vaccted superhigh dosage of hepatitis B surface antigen.Methods:NIH mice were treated with 600μg.Kg-1.d-1 by hypodermic injection for 21d, then one monthlyconvalesent term. Anti-HBs-IgG and its subclass(IgG1、IgG2a) in mice serawere dectected by ELISA.Results:The superhigh dosage of hepatitis B surface antigen Vaccine still excited body product high levels of anti-HBs-IgG and Its IgG1 in 3th week and convalesent phase, but low levels of IgG2a Could not be deteeted untill Convalesent phase.Conclusion:The results shows that the superhigh dosage of hepatitis B surface antigen Vaccine is safe, may induced high leve specific IgG in 3th week and cell immunity in 8th week, the same with the high dosage Vaccine.
【Key words】 Hepatitis B surfade Vaccine anti-HBs-IgG IgG1 IgG2a
近年的研究表明,一些慢性乙型肝炎患者在接种含有HBsAg或其他HBV相关蛋白疫苗后可检测到特异性免疫反应,并取得抗病毒效果[1~4]。因此治疗性疫苗的研制为慢性乙肝治疗提供了一个新的研究方向。
目前对HBsAg疫苗诱导机体产生特异性抗体及亚类的研究已有些报道,但超高剂量HBsAg疫苗诱发机体产生IgG及其亚类抗HBs变化研究还是空白[5~6]。本研究是在对超高剂量(约为人临床拟用量600倍)HBsAg疫苗对小鼠进行长期毒性试验中观察(Ⅰ)协助检测HBsAg疫苗的安全性;(Ⅱ)诱发小鼠产生IgG及其亚型抗HBs水平。
1 材料与方法
1.1 试验材料。HBsAg疫苗由深圳康泰股份有限公司制备,批号:T010702,每支1ml,乙肝疫苗60μg。临用前用铝稀释剂稀释,配成所需的注射溶液。
1.2 小鼠来源、分组及血清采集。SPF级NIH小鼠,雌雄兼半,体重为18~24g,由广州中医药大学实验动物中心提供。实验分为给药组和对照组,给药剂量为600μg/kg(约为人临床拟用量的600倍数),每天给药一次,连续21天,皮下注射,0.2ml/只,对照组注射等体积铝稀释剂,每组10只,于给药3周和末次免疫后一个月后分别从小鼠眼静脉取血,分离血清保存于-20℃待测。
1.3 IgG及IgG亚类抗HBs检测。
抗HBs ELISA检测试剂盒购自上海实业科华生物技术有限公司。HRP标记的羊抗小鼠IgG2a和IgG1为Serotec公司产品,作为第二抗体。
2 结果和小结
2.1 实验小鼠诱生抗HBs的动态。连续给予超高剂量治疗性HBsAg疫苗,3周可诱导全部小鼠产生高水平的抗HBs,末次免疫后一个月,小鼠血清中抗HBsIgG仍保持高水平并有增高趋势(见表Ⅰ),表明超高剂量HBsAg疫苗仍可刺激机体产生高水平特异性抗体,未产生毒性或耐受作用。
表 Ⅰ 超高剂量疫苗诱生小鼠产生抗HBsIgG的结果(x±s)
2.2 特异性IgG亚类抗HBs的变化。结果表明连续给予超高剂量HBsAg疫苗3周时诱导抗体产生抗HBs的IgG的亚类主要为IgG1,产生IgG2a阳性率仅为10%,且滴度很低,到末次免疫一个月后IgG2a类抗HBs水平才有显著增高,阳性率可达到90%,但与IgG1 OD值相比低8倍多。IgG1类抗HBs仍保持高水平,与3周时滴度水平无显著差异(见表Ⅱ),这表明超高剂量HBsAg疫苗对诱导机体产生IgG2a类抗HBs在水平和时间上与高剂量HBsAg疫苗规律基本一致。
表 Ⅱ IgG亚类抗HBs分布情况(x±s)
3 讨 论
本研究对小鼠抗-HBs-IgG及其亚类的测定表明超高剂量乙肝疫苗对小鼠机体免疫无毒性作用,仍可刺激机体产生高水平抗-HBs-IgG1,这一研究填补高剂量治疗性乙肝疫苗诱导机体免疫系统研究的空白,丰富了治疗性乙肝疫苗的研究内容。
目前对治疗性乙肝疫苗对慢性乙型肝炎的治疗作用机制尚未阐明,可能是通过改变增强抗原提呈的方式,诱生淋巴因子和细胞因子来刺激T细胞反应,主要产生特异性CTL而产生治疗效应,Cocillin等[1]对GenHerac B疫苗接种的CHB患者中,抗原特异性PBMC增殖反应率明显高于对照组,41.2%的患者发生强而持久的细胞免疫反应。本课题组用治疗剂量乙肝疫苗对小鼠试验,通过T淋巴试验,特异性CTL试验细胞因子IL-2、IFN-γ及抗-HBs-IgG2a检测,都表明治疗性乙肝疫苗可显著增强机体细胞免疫[7]。治疗性蛋白疫苗和DNA疫苗不同已往预防疫苗的重要区别于其可显著提高了机体细胞免疫,特别是特异性CTL免疫,打破免疫耐受,而达到治疗CHB作用[8~9]。
近十年来对鼠和人研究表明,细胞因子是IgG亚类反应的主要调控因素。在小鼠中,Th1主要分泌IL-1和IFN-γ,促进IgG2a亚类的产生,诱导细胞免疫和激活T杀伤性细胞,而Th2则分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10,促进IgG1亚类的合成与变态反应有关,因此在免疫和疾病中检测IgG亚类变化,可以监测机体抗体变化及免疫反应类型的变化[10~11]。蛋白疫苗和DNA疫苗一些研究已表明,注射治疗性疫苗可刺激抗体产生的IgG2a为主的免疫反应(即Th1型为主),但在本研究中,实验结果表明超高剂量治疗性乙肝疫苗可刺激抗体产生高水平IgG1为主的免疫反应(即Th2型),并持续时间较长,而IgG2a的产生水平很低,出现时间较迟,这表明超高剂量治疗性乙肝疫苗虽对机体免疫系统无毒性作用,可产生高水平抗-HBs-IgG1,但对细胞免疫反应有一定抑制作用,而表现出抗-HBs-IgG2a水平很低,出现较迟。IgG2a与IgG1 OD值差约8倍。从一般免疫理论来说,大剂量蛋白抗原的反复刺激容易诱导特异性T淋巴细胞耐受,抑制免疫反应,而大量的多糖类抗原可以诱导特异性B细胞耐受,从而抑制抗体的产生[12]。本研究结果与上述免疫应答的调节理论相一致。
上述试验结果表明超高剂量HBsAg疫苗对机体不仅无毒性作用,且可诱导机体产生高水平IgG及IgG1类抗HBs,在晚期也诱生细胞免疫相关的IgG2类抗HBs,可能与免疫时间较短有关,从而更加证实我们拟用 60μg/人次高剂量HBsAg作为免疫调解剂应用临床具有很大的安全性。
鸣谢:本试验由广州医药工业研究所全国临床前药品安全性重点研究室具体实施,对本研究帮助表示感谢!
参考文献
1 Couillin I,et al.Specific Vaccine Therapy in chronic Hepatitis B:induction of T Cell Proliferative Responses Specific for Envelope Antigens.J infect Dis,1999;180(1):15~26
2 Pols,et al.Spcific Vaccine therapy in chronic hepatitis B infection.Lancet,1994;349:342
3 Ishioka GY,et al.Utilization of MHC class I transgenic mice for the development of minigene Vaccine encoding multiple HLA-restricted CTL epitopes.J Immunol,1999;162:3915~3925
4 Livingston BD,et al.The hepatitis B Virus-specific CTL responses induced in humans by lipopetide Vaccination are Comparable to those elicited by acute viral infection.J Immunol,1997:1383~1392
5 黄祖瑚等.HBcAg DNA疫苗诱导(H-2b)特异性细胞和体液免疫应答.中华传染病杂志,1999;5:17(2):104~107
6 Gregorek H,et al.The IgG subclass profile of anti-HBs response in vaccinated children and children seroconverted after natural infection.Vaccine,2000(18):1210~1217
7 熊一力等.HBsAg疫苗对非溶细胞性和溶细胞性细胞免疫应答的影响.世界华人消化杂志,2003;(11):1802~1804
8 Kuhober A,et al.DNA immunization inducal antibody and cytotoxic T Cell responses to hepatitis B core antigen in H-2b mice.J Immunol,1996;156:3687~3695
9 Geissler M,et al.Cellular and humoral immune response to hepatitis B Virus structure proteins in mice after DNA-based immunization.Gastroenterology,1997;112:1307~1320
10 Snapper CM,et al.Towards a comprehensive view of immunoglobulin calss switching.Immunol Today,1993;14:15~7
11 Kawano Y,et al.Regulation of human IgG subclass production by cytokines:human IgG subclass production enhanced differentially by interleukin-6 Immunology,1995;84:278~84
12 林学颜等主编.现代细胞与分子免疫学.北京科学出版社,1999;8:200~203
【关键词】 乙肝HBsAg疫苗 抗-HBs-IgG IgG1 IgG2a
Effect of Superhigh Dose hepatitis B surface antigen Vaccine on the specific antibody induced in mice
Liu Guangze,et al
【Abstract】 Objective:To study the safe and the specific immune responses of anti-HBs-IgG and subclass in mice, after serial Vaccted superhigh dosage of hepatitis B surface antigen.Methods:NIH mice were treated with 600μg.Kg-1.d-1 by hypodermic injection for 21d, then one monthlyconvalesent term. Anti-HBs-IgG and its subclass(IgG1、IgG2a) in mice serawere dectected by ELISA.Results:The superhigh dosage of hepatitis B surface antigen Vaccine still excited body product high levels of anti-HBs-IgG and Its IgG1 in 3th week and convalesent phase, but low levels of IgG2a Could not be deteeted untill Convalesent phase.Conclusion:The results shows that the superhigh dosage of hepatitis B surface antigen Vaccine is safe, may induced high leve specific IgG in 3th week and cell immunity in 8th week, the same with the high dosage Vaccine.
【Key words】 Hepatitis B surfade Vaccine anti-HBs-IgG IgG1 IgG2a
近年的研究表明,一些慢性乙型肝炎患者在接种含有HBsAg或其他HBV相关蛋白疫苗后可检测到特异性免疫反应,并取得抗病毒效果[1~4]。因此治疗性疫苗的研制为慢性乙肝治疗提供了一个新的研究方向。
目前对HBsAg疫苗诱导机体产生特异性抗体及亚类的研究已有些报道,但超高剂量HBsAg疫苗诱发机体产生IgG及其亚类抗HBs变化研究还是空白[5~6]。本研究是在对超高剂量(约为人临床拟用量600倍)HBsAg疫苗对小鼠进行长期毒性试验中观察(Ⅰ)协助检测HBsAg疫苗的安全性;(Ⅱ)诱发小鼠产生IgG及其亚型抗HBs水平。
1 材料与方法
1.1 试验材料。HBsAg疫苗由深圳康泰股份有限公司制备,批号:T010702,每支1ml,乙肝疫苗60μg。临用前用铝稀释剂稀释,配成所需的注射溶液。
1.2 小鼠来源、分组及血清采集。SPF级NIH小鼠,雌雄兼半,体重为18~24g,由广州中医药大学实验动物中心提供。实验分为给药组和对照组,给药剂量为600μg/kg(约为人临床拟用量的600倍数),每天给药一次,连续21天,皮下注射,0.2ml/只,对照组注射等体积铝稀释剂,每组10只,于给药3周和末次免疫后一个月后分别从小鼠眼静脉取血,分离血清保存于-20℃待测。
1.3 IgG及IgG亚类抗HBs检测。
抗HBs ELISA检测试剂盒购自上海实业科华生物技术有限公司。HRP标记的羊抗小鼠IgG2a和IgG1为Serotec公司产品,作为第二抗体。
2 结果和小结
2.1 实验小鼠诱生抗HBs的动态。连续给予超高剂量治疗性HBsAg疫苗,3周可诱导全部小鼠产生高水平的抗HBs,末次免疫后一个月,小鼠血清中抗HBsIgG仍保持高水平并有增高趋势(见表Ⅰ),表明超高剂量HBsAg疫苗仍可刺激机体产生高水平特异性抗体,未产生毒性或耐受作用。
表 Ⅰ 超高剂量疫苗诱生小鼠产生抗HBsIgG的结果(x±s)
2.2 特异性IgG亚类抗HBs的变化。结果表明连续给予超高剂量HBsAg疫苗3周时诱导抗体产生抗HBs的IgG的亚类主要为IgG1,产生IgG2a阳性率仅为10%,且滴度很低,到末次免疫一个月后IgG2a类抗HBs水平才有显著增高,阳性率可达到90%,但与IgG1 OD值相比低8倍多。IgG1类抗HBs仍保持高水平,与3周时滴度水平无显著差异(见表Ⅱ),这表明超高剂量HBsAg疫苗对诱导机体产生IgG2a类抗HBs在水平和时间上与高剂量HBsAg疫苗规律基本一致。
表 Ⅱ IgG亚类抗HBs分布情况(x±s)
3 讨 论
本研究对小鼠抗-HBs-IgG及其亚类的测定表明超高剂量乙肝疫苗对小鼠机体免疫无毒性作用,仍可刺激机体产生高水平抗-HBs-IgG1,这一研究填补高剂量治疗性乙肝疫苗诱导机体免疫系统研究的空白,丰富了治疗性乙肝疫苗的研究内容。
目前对治疗性乙肝疫苗对慢性乙型肝炎的治疗作用机制尚未阐明,可能是通过改变增强抗原提呈的方式,诱生淋巴因子和细胞因子来刺激T细胞反应,主要产生特异性CTL而产生治疗效应,Cocillin等[1]对GenHerac B疫苗接种的CHB患者中,抗原特异性PBMC增殖反应率明显高于对照组,41.2%的患者发生强而持久的细胞免疫反应。本课题组用治疗剂量乙肝疫苗对小鼠试验,通过T淋巴试验,特异性CTL试验细胞因子IL-2、IFN-γ及抗-HBs-IgG2a检测,都表明治疗性乙肝疫苗可显著增强机体细胞免疫[7]。治疗性蛋白疫苗和DNA疫苗不同已往预防疫苗的重要区别于其可显著提高了机体细胞免疫,特别是特异性CTL免疫,打破免疫耐受,而达到治疗CHB作用[8~9]。
近十年来对鼠和人研究表明,细胞因子是IgG亚类反应的主要调控因素。在小鼠中,Th1主要分泌IL-1和IFN-γ,促进IgG2a亚类的产生,诱导细胞免疫和激活T杀伤性细胞,而Th2则分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10,促进IgG1亚类的合成与变态反应有关,因此在免疫和疾病中检测IgG亚类变化,可以监测机体抗体变化及免疫反应类型的变化[10~11]。蛋白疫苗和DNA疫苗一些研究已表明,注射治疗性疫苗可刺激抗体产生的IgG2a为主的免疫反应(即Th1型为主),但在本研究中,实验结果表明超高剂量治疗性乙肝疫苗可刺激抗体产生高水平IgG1为主的免疫反应(即Th2型),并持续时间较长,而IgG2a的产生水平很低,出现时间较迟,这表明超高剂量治疗性乙肝疫苗虽对机体免疫系统无毒性作用,可产生高水平抗-HBs-IgG1,但对细胞免疫反应有一定抑制作用,而表现出抗-HBs-IgG2a水平很低,出现较迟。IgG2a与IgG1 OD值差约8倍。从一般免疫理论来说,大剂量蛋白抗原的反复刺激容易诱导特异性T淋巴细胞耐受,抑制免疫反应,而大量的多糖类抗原可以诱导特异性B细胞耐受,从而抑制抗体的产生[12]。本研究结果与上述免疫应答的调节理论相一致。
上述试验结果表明超高剂量HBsAg疫苗对机体不仅无毒性作用,且可诱导机体产生高水平IgG及IgG1类抗HBs,在晚期也诱生细胞免疫相关的IgG2类抗HBs,可能与免疫时间较短有关,从而更加证实我们拟用 60μg/人次高剂量HBsAg作为免疫调解剂应用临床具有很大的安全性。
鸣谢:本试验由广州医药工业研究所全国临床前药品安全性重点研究室具体实施,对本研究帮助表示感谢!
参考文献
1 Couillin I,et al.Specific Vaccine Therapy in chronic Hepatitis B:induction of T Cell Proliferative Responses Specific for Envelope Antigens.J infect Dis,1999;180(1):15~26
2 Pols,et al.Spcific Vaccine therapy in chronic hepatitis B infection.Lancet,1994;349:342
3 Ishioka GY,et al.Utilization of MHC class I transgenic mice for the development of minigene Vaccine encoding multiple HLA-restricted CTL epitopes.J Immunol,1999;162:3915~3925
4 Livingston BD,et al.The hepatitis B Virus-specific CTL responses induced in humans by lipopetide Vaccination are Comparable to those elicited by acute viral infection.J Immunol,1997:1383~1392
5 黄祖瑚等.HBcAg DNA疫苗诱导(H-2b)特异性细胞和体液免疫应答.中华传染病杂志,1999;5:17(2):104~107
6 Gregorek H,et al.The IgG subclass profile of anti-HBs response in vaccinated children and children seroconverted after natural infection.Vaccine,2000(18):1210~1217
7 熊一力等.HBsAg疫苗对非溶细胞性和溶细胞性细胞免疫应答的影响.世界华人消化杂志,2003;(11):1802~1804
8 Kuhober A,et al.DNA immunization inducal antibody and cytotoxic T Cell responses to hepatitis B core antigen in H-2b mice.J Immunol,1996;156:3687~3695
9 Geissler M,et al.Cellular and humoral immune response to hepatitis B Virus structure proteins in mice after DNA-based immunization.Gastroenterology,1997;112:1307~1320
10 Snapper CM,et al.Towards a comprehensive view of immunoglobulin calss switching.Immunol Today,1993;14:15~7
11 Kawano Y,et al.Regulation of human IgG subclass production by cytokines:human IgG subclass production enhanced differentially by interleukin-6 Immunology,1995;84:278~84
12 林学颜等主编.现代细胞与分子免疫学.北京科学出版社,1999;8:200~203