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摘要[目的]抑制大豆分离蛋白（SPI）中的美拉德反应，提高产品稳定性。[方法]向SPI-葡萄糖混合体系中添加不同量的L-半胱氨酸、槲皮素，通过测定溶解度、紫外和荧光吸收来判定各添加剂对蛋白溶解性下降和美拉德反应的抑制作用。[结果]添加1%的L-半胱氨酸能明显改善SPI溶解度下降和美拉德反应的问题，而槲皮素未能提高该体系的贮藏稳定性。[结论]该研究为SPI贮藏稳定性的有效控制提供了途径。
关键词 大豆分离蛋白；L-半胱氨酸；槲皮素；稳定性；溶解性
中圖分类号 TS201.2+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）03-0083-03
Abstract[Objective] This research was performed in order to inhibit the Maillard reaction and improve the storage stability of soybean protein isolate （SPI）. [Method]Different amounts of Lcysteine and quercetin were added into SPI to investigate their effects on the solubility and Maillard reaction of protein by determining its solubility， UV and fluorescence absorbance. [Result]1%Lcysteine inhibited the solubility decrease and Maillard reaction of SPI during storage， while quercetin had no inhibitive effect on them. [Conclusion] This result provided one effective control method to the storage stability of SPI.
Key words Soy protein isolate （SPI）；Lcysteine；Quercetin；Stability；Solubility
大豆分离蛋白（SPI）是一种在食品工业中非常重要的植物蛋白产品，其蛋白质含量高达90%以上，且消化利用率较高，可达93%～97%；含有8种人体必需氨基酸，且某些氨基酸含量超过联合国粮农组织/世界卫生组织（FAO/WHO）所推荐标准。SPI的主要组成元素为C、H、O、N、S、P，其氨基酸组成有甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、脯氨酸、赖氨酸和色氨酸等，同时还含有大量人体必需脂肪酸、磷脂，丰富的钙、磷等矿物质，而且不含胆固醇，有益于人体健康，具有较高的营养价值[1-2]。SPI已被广泛应用于食品及其他行业中，可用于改善肉制品凝胶性，提高冰淇淋产品的膨胀率，还可用于改善面制品中小麦粉的加工性能，提高小麦粉的蒸煮品质和营养价值等。
SPI在常温贮藏中溶解性质下降显著，严重影响了其工业应用价值，但目前尚无很好的解决方法。研究证明，蛋白在固态下会发生物理变化和化学变化。物理变化有变性、非共价聚集、沉淀；化学变化包括共价聚集、去酰化、氧化、美拉德反应等[3]。Davies等[4]研究发现，在不同的温度和水分活度下贮藏，SPI发生了褐变。通过进一步研究发现，SPI中的染料木素是造成非酶褐变的重要反应物之一，暗示SPI的长期贮藏会导致染料木素的损失。所以针对蛋白在固态下的品质损失，人们可使用相应的抑制剂来阻断其中某种或某几种途径的进行。
笔者以葡萄糖和SPI的混合物为模拟体系，研究L-半胱氨酸和槲皮素对固态SPI结构和功能性的影响，并进一步探讨造成功能性下降的內在原因，以及相应的控制方法，以期为提高SPI贮藏稳定性和延长产品贮藏期提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
低温脱脂豆粕，蛋白质含量46.96%，水分6.67%，秦皇岛金海粮油集团；槲皮素，美国Sigma公司；其他试剂（AR），国药集团化学试剂有限公司。
主要设备：
机械搅拌器、磁力搅拌器，广州仪科实验仪器有限公司；650-60型荧光分光光度计，日本HITACHI公司；UV-2800H型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 SPI的提取工艺。
脱脂豆粉粉碎过80目筛，豆粉与水1∶8（W/V），用3 mol/L NaOH调pH至7.8，50 ℃搅拌45 min，离心10 min（6 527 r/min，4 ℃），取上清液。用3 mol/L HCl将上清液pH调至4.5，40 ℃下搅拌10 min，离心10 min（6 527 r/min，4 ℃），取沉淀。将沉淀复溶，配制成10%的SPI溶液，调pH到7.0，均质（40 MPa），喷雾干燥（进风温度180 ℃，出风温度80 ℃）即得SPI。
1.2.2 SPI的贮藏。
将提取出的SPI进行水分调节，使其水分含量保持在4%左右，密封于PE袋中，置于37 ℃恒温生化培养箱中避光保存。
1.2.3 溶解度的测定。
蛋白质的溶解度用氮溶解指数（NSI）表示[5]。将浓度约10 mg/mL的蛋白溶液，在室温下磁力搅拌1 h，取5 mL样液用凯式定氮法测定蛋白含量，即为总蛋白含量。然后离心15 min（6 527 r/min），取上清液5 mL，采用凯式定氮法测定可溶性蛋白含量。凯式定氮相关操作参照GB/T 5009.5—2010食品中蛋白质的测定方法。
NSI=可溶性蛋白量/总蛋白量×100% 1.2.4 紫外吸收的测定。
参考Ajandouz等[6]的方法，用去离子水将已知蛋白浓度的样液稀释至1 mg/mL，于室温下在294 nm处使用紫外分光光度计测定其紫外吸光值，空白为去离子水。
1.2.5 荧光测定。
参考Morales等[7]的试验方法，将样品稀释至蛋白浓度为1 mg/mL，使用650-60型荧光分光光度计在激发波长347 nm、发射波长415 nm处（狭缝5 nm）测定荧光强度，空白为去离子水。
1.3 數据统计分析
该试验所有数据均为2次重复3次平行得到的平均值。使用Statistix软件，采用LSD方法对数据进行显著性统计分析（P≤0.05）。
2 结果与分析
2.1 L-半胱氨酸对SPI贮藏稳定性的影响
由图1可知，在50 ℃下贮藏10 d内，各组蛋白的溶解度均有不同程度的降低。0 G-SPI降低了21%，5.00%G-SPI降低25%，0.01%Cys-SPI降低25%，1.00%Cys-SPI降低20%，且添加L-半胱氨酸的蛋白溶解度始终高于0 G-SPI和5.00%G-SPI的溶解度。可见，L-半胱氨酸对高糖含量大豆蛋白溶解度的下降有明显的抑制作用，且抑制程度随着L-半胱氨酸添加量的增加而增强。
图2显示了各组大豆蛋白在294 nm处的紫外吸收强度随贮藏时间的变化情况。4组蛋白的吸收强度大体上都呈现出相同的变化趋势，在前6 d都显著下降，可能是由于前期蛋白氧化聚集较明显，蛋白本身的酪氨酸、色氨酸等在280 nm附近与有强吸收的氨基酸发生了交联反应，导致294 nm处的吸光强度降低，而6 d以后各组蛋白的紫外吸收又大幅度增大。可见，294 nm处的紫外吸收也并不是完全由美拉德反应决定的，还受蛋白本身内源荧光的影响。但就贮藏末期和初期相较而言，0 G-SPI的紫外吸收减小1.4%，5.00%G-SPI增大6.0%，0.01%Cys-SPI增大2.9%，1.00%Cys-SPI增大2.9%，可见L-半胱氨酸还是抑制了在294 nm处有吸收的物质的生成。
由图3可见，各组SPI在λex=347 nm、λem=415 nm处的荧光吸收随贮藏时间的变化显示，荧光强度均在贮藏期间有不同程度的增大。0 G-SPI增大35%，5.00% G-SPI增大50%，0.01% Cys-SPI增大52%，1.00% Cys-SPI增大33%。可见，1.00%的L-半胱氨酸显著减缓了蛋白荧光吸收的增强，而0.01%的L-半胱氨酸对其荧光吸收的变化无明显作用。由此可见，1.00%的L-半胱氨酸对美拉德反应有明显的抑制效应。Scaman等[8]研究发现，在不同pH和温度的反应条件下，L-半胱氨酸都能抑制糖基化反应，因为它所含的巯基不论在体内还是体外，都能起到类似于还原剂的作用，并具有很强的亲核性，能截留亲电性的化合物和中间体。
2.2 槲皮素對SPI贮藏稳定性的影响
由图4可以看出，槲皮素的添加并没有显著缓解溶解度降低的趋势，除了前2 d略有增大外，整个贮藏期间依然有明显下降。这种变化暗示槲皮素在贮藏前期可能对氧化反应起到了一定的抑制效应，但在中后期的贮藏过程中，可能与大分子的蛋白作用不大，因而对大豆蛋白溶解度没有太大影响。
而在294 nm处紫外吸收的变动则比较复杂，由图5可知，在贮藏前2 d，1.00% Q-SPI的吸收强度有较大增加，然后又显著减小，再逐渐增大，这种变化可能是由于槲皮素本身与蛋白分子结合，导致蛋白构象发生了一系列变化而引起的。在整个贮藏期间，0 G-SPI的紫外吸收强度下降了1.4%，5.00% G-SPI上升6.0%，0.01% Q-SPI上升4.4%，0.10% Q-SPI上升7.5%，1.00% Q-SPI上升5.8%，可见槲皮素的添加量不同，对紫外吸收的影响也不同。
从图6中的荧光吸收强度来看，0.10% Q-SPI在贮藏期间荧光强度反倒增大了55%，略高于5.00% G-SPI，0.01% Q-SPI和1.00% Q-SPI的变化则与5.00% G-SPI无明显差别。可见，槲皮素在该体系中并未对美拉德反应表现出抑制作用。可能是由于槲皮素本身水溶性较差，又在低水分体系中，所以其稳定性较好，而且槲皮素的分子大小与蛋白悬殊较大，因而其作用机制也与之前的研究有较大差别，所以在该体系中槲皮素未能有效抑制美拉德反应。
3 结论
L-半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中唯一具有还原性基团巯基（-SH）的氨基酸，通过改变蛋白质分子之间和蛋白质分子内部的二硫键，减弱了蛋白质的结构，使蛋白质结构伸展开来。
槲皮素是黄酮类化合物的一种，具有抑制非酶褐变的效用。Rawel等[9]研究槲皮素与乳清蛋白的相互作用时发现，槲皮素能有效阻断蛋白中的赖氨酸、胱氨酸和色氨酸残基，并且槲皮素能改变蛋白的疏水性，从而导致蛋白结构发生变化，影响其功能性质。
该研究发现，L-半胱氨酸能显著抑制大豆蛋白溶解度的下降，并对美拉德反应也有显著的抑制效应，同时也可能存在强还原作用，而槲皮素的添加并没有显著缓解溶解度降低的趋势且未能有效抑制美拉德反应。
参考文献
[1] 李玉珍，肖怀秋，兰立新.大豆分离蛋白功能特性及其在食品工业中的应用[J].中国食品添加剂，2008（1）：121-124.
[2] 田琨，管娟，邵正中，等.大豆分离蛋白结构与性能[J].化学进展，2008，20（4）：565-573.
[3] CHANG L Q，PIKAL M J.Mechanisms of protein stabilization in the solidstate[J].Journal of pharmaceutical science，2009，98（9）：2886-2908. [4] DAVIES C G A，NETTO F M，GLASSENAP N，et al.Indication of the Maillard reaction during storage of protein isolates[J].Journal of agricultural and food chemistry，1998，46（7）：2485-2489.
[5] WAGNER J R，SORGENTINI D A，AN M C.Relation between solubility and surface hydrophobicity as an indicator of modifications during preparation processes of commercial and laboratoryprepared soy protein isolates[J].Journal of agricultural and food chemistry，2000，48（8）：3159-3165.
[6] AJANDOUZ E H，TSCHIAPE L S，DALLE ORE F，et al.Effects of pH on caramelization and Maillard reaction kinetics in fructoselysine model systems[J].Journal of food science，2006，66（7）：926-931.
[7] MORALES F J，JIMNEZPREZ S.Free radical scavenging capacity of Maillard reaction products as related to colour and fluorescence[J].Food chemistry，2001，72（1）：119-125.
[8] SCAMAN C，NAKAI S，AMINLARI M.Effect of pH，temperature and sodium bisulfite or cysteine on the level of Maillardbased conjugation of lysozyme with dextran，galactomannan and mannan[J].Food chemistry，2006，99（2）：368-380.
[9] RAWEL H M，ROHN S，KROLL J.Influence of a sugar moiety（rhamnosylglucoside）at 3O position on the reactivity of quercetin with whey proteins[J].International journal of biological macromolecules，2003，32（3/4/5）：109-120.
关键词 大豆分离蛋白；L-半胱氨酸；槲皮素；稳定性；溶解性
中圖分类号 TS201.2+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）03-0083-03
Abstract[Objective] This research was performed in order to inhibit the Maillard reaction and improve the storage stability of soybean protein isolate （SPI）. [Method]Different amounts of Lcysteine and quercetin were added into SPI to investigate their effects on the solubility and Maillard reaction of protein by determining its solubility， UV and fluorescence absorbance. [Result]1%Lcysteine inhibited the solubility decrease and Maillard reaction of SPI during storage， while quercetin had no inhibitive effect on them. [Conclusion] This result provided one effective control method to the storage stability of SPI.
Key words Soy protein isolate （SPI）；Lcysteine；Quercetin；Stability；Solubility
大豆分离蛋白（SPI）是一种在食品工业中非常重要的植物蛋白产品，其蛋白质含量高达90%以上，且消化利用率较高，可达93%～97%；含有8种人体必需氨基酸，且某些氨基酸含量超过联合国粮农组织/世界卫生组织（FAO/WHO）所推荐标准。SPI的主要组成元素为C、H、O、N、S、P，其氨基酸组成有甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、脯氨酸、赖氨酸和色氨酸等，同时还含有大量人体必需脂肪酸、磷脂，丰富的钙、磷等矿物质，而且不含胆固醇，有益于人体健康，具有较高的营养价值[1-2]。SPI已被广泛应用于食品及其他行业中，可用于改善肉制品凝胶性，提高冰淇淋产品的膨胀率，还可用于改善面制品中小麦粉的加工性能，提高小麦粉的蒸煮品质和营养价值等。
SPI在常温贮藏中溶解性质下降显著，严重影响了其工业应用价值，但目前尚无很好的解决方法。研究证明，蛋白在固态下会发生物理变化和化学变化。物理变化有变性、非共价聚集、沉淀；化学变化包括共价聚集、去酰化、氧化、美拉德反应等[3]。Davies等[4]研究发现，在不同的温度和水分活度下贮藏，SPI发生了褐变。通过进一步研究发现，SPI中的染料木素是造成非酶褐变的重要反应物之一，暗示SPI的长期贮藏会导致染料木素的损失。所以针对蛋白在固态下的品质损失，人们可使用相应的抑制剂来阻断其中某种或某几种途径的进行。
笔者以葡萄糖和SPI的混合物为模拟体系，研究L-半胱氨酸和槲皮素对固态SPI结构和功能性的影响，并进一步探讨造成功能性下降的內在原因，以及相应的控制方法，以期为提高SPI贮藏稳定性和延长产品贮藏期提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
低温脱脂豆粕，蛋白质含量46.96%，水分6.67%，秦皇岛金海粮油集团；槲皮素，美国Sigma公司；其他试剂（AR），国药集团化学试剂有限公司。
主要设备：
机械搅拌器、磁力搅拌器，广州仪科实验仪器有限公司；650-60型荧光分光光度计，日本HITACHI公司；UV-2800H型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 SPI的提取工艺。
脱脂豆粉粉碎过80目筛，豆粉与水1∶8（W/V），用3 mol/L NaOH调pH至7.8，50 ℃搅拌45 min，离心10 min（6 527 r/min，4 ℃），取上清液。用3 mol/L HCl将上清液pH调至4.5，40 ℃下搅拌10 min，离心10 min（6 527 r/min，4 ℃），取沉淀。将沉淀复溶，配制成10%的SPI溶液，调pH到7.0，均质（40 MPa），喷雾干燥（进风温度180 ℃，出风温度80 ℃）即得SPI。
1.2.2 SPI的贮藏。
将提取出的SPI进行水分调节，使其水分含量保持在4%左右，密封于PE袋中，置于37 ℃恒温生化培养箱中避光保存。
1.2.3 溶解度的测定。
蛋白质的溶解度用氮溶解指数（NSI）表示[5]。将浓度约10 mg/mL的蛋白溶液，在室温下磁力搅拌1 h，取5 mL样液用凯式定氮法测定蛋白含量，即为总蛋白含量。然后离心15 min（6 527 r/min），取上清液5 mL，采用凯式定氮法测定可溶性蛋白含量。凯式定氮相关操作参照GB/T 5009.5—2010食品中蛋白质的测定方法。
NSI=可溶性蛋白量/总蛋白量×100% 1.2.4 紫外吸收的测定。
参考Ajandouz等[6]的方法，用去离子水将已知蛋白浓度的样液稀释至1 mg/mL，于室温下在294 nm处使用紫外分光光度计测定其紫外吸光值，空白为去离子水。
1.2.5 荧光测定。
参考Morales等[7]的试验方法，将样品稀释至蛋白浓度为1 mg/mL，使用650-60型荧光分光光度计在激发波长347 nm、发射波长415 nm处（狭缝5 nm）测定荧光强度，空白为去离子水。
1.3 數据统计分析
该试验所有数据均为2次重复3次平行得到的平均值。使用Statistix软件，采用LSD方法对数据进行显著性统计分析（P≤0.05）。
2 结果与分析
2.1 L-半胱氨酸对SPI贮藏稳定性的影响
由图1可知，在50 ℃下贮藏10 d内，各组蛋白的溶解度均有不同程度的降低。0 G-SPI降低了21%，5.00%G-SPI降低25%，0.01%Cys-SPI降低25%，1.00%Cys-SPI降低20%，且添加L-半胱氨酸的蛋白溶解度始终高于0 G-SPI和5.00%G-SPI的溶解度。可见，L-半胱氨酸对高糖含量大豆蛋白溶解度的下降有明显的抑制作用，且抑制程度随着L-半胱氨酸添加量的增加而增强。
图2显示了各组大豆蛋白在294 nm处的紫外吸收强度随贮藏时间的变化情况。4组蛋白的吸收强度大体上都呈现出相同的变化趋势，在前6 d都显著下降，可能是由于前期蛋白氧化聚集较明显，蛋白本身的酪氨酸、色氨酸等在280 nm附近与有强吸收的氨基酸发生了交联反应，导致294 nm处的吸光强度降低，而6 d以后各组蛋白的紫外吸收又大幅度增大。可见，294 nm处的紫外吸收也并不是完全由美拉德反应决定的，还受蛋白本身内源荧光的影响。但就贮藏末期和初期相较而言，0 G-SPI的紫外吸收减小1.4%，5.00%G-SPI增大6.0%，0.01%Cys-SPI增大2.9%，1.00%Cys-SPI增大2.9%，可见L-半胱氨酸还是抑制了在294 nm处有吸收的物质的生成。
由图3可见，各组SPI在λex=347 nm、λem=415 nm处的荧光吸收随贮藏时间的变化显示，荧光强度均在贮藏期间有不同程度的增大。0 G-SPI增大35%，5.00% G-SPI增大50%，0.01% Cys-SPI增大52%，1.00% Cys-SPI增大33%。可见，1.00%的L-半胱氨酸显著减缓了蛋白荧光吸收的增强，而0.01%的L-半胱氨酸对其荧光吸收的变化无明显作用。由此可见，1.00%的L-半胱氨酸对美拉德反应有明显的抑制效应。Scaman等[8]研究发现，在不同pH和温度的反应条件下，L-半胱氨酸都能抑制糖基化反应，因为它所含的巯基不论在体内还是体外，都能起到类似于还原剂的作用，并具有很强的亲核性，能截留亲电性的化合物和中间体。
2.2 槲皮素對SPI贮藏稳定性的影响
由图4可以看出，槲皮素的添加并没有显著缓解溶解度降低的趋势，除了前2 d略有增大外，整个贮藏期间依然有明显下降。这种变化暗示槲皮素在贮藏前期可能对氧化反应起到了一定的抑制效应，但在中后期的贮藏过程中，可能与大分子的蛋白作用不大，因而对大豆蛋白溶解度没有太大影响。
而在294 nm处紫外吸收的变动则比较复杂，由图5可知，在贮藏前2 d，1.00% Q-SPI的吸收强度有较大增加，然后又显著减小，再逐渐增大，这种变化可能是由于槲皮素本身与蛋白分子结合，导致蛋白构象发生了一系列变化而引起的。在整个贮藏期间，0 G-SPI的紫外吸收强度下降了1.4%，5.00% G-SPI上升6.0%，0.01% Q-SPI上升4.4%，0.10% Q-SPI上升7.5%，1.00% Q-SPI上升5.8%，可见槲皮素的添加量不同，对紫外吸收的影响也不同。
从图6中的荧光吸收强度来看，0.10% Q-SPI在贮藏期间荧光强度反倒增大了55%，略高于5.00% G-SPI，0.01% Q-SPI和1.00% Q-SPI的变化则与5.00% G-SPI无明显差别。可见，槲皮素在该体系中并未对美拉德反应表现出抑制作用。可能是由于槲皮素本身水溶性较差，又在低水分体系中，所以其稳定性较好，而且槲皮素的分子大小与蛋白悬殊较大，因而其作用机制也与之前的研究有较大差别，所以在该体系中槲皮素未能有效抑制美拉德反应。
3 结论
L-半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中唯一具有还原性基团巯基（-SH）的氨基酸，通过改变蛋白质分子之间和蛋白质分子内部的二硫键，减弱了蛋白质的结构，使蛋白质结构伸展开来。
槲皮素是黄酮类化合物的一种，具有抑制非酶褐变的效用。Rawel等[9]研究槲皮素与乳清蛋白的相互作用时发现，槲皮素能有效阻断蛋白中的赖氨酸、胱氨酸和色氨酸残基，并且槲皮素能改变蛋白的疏水性，从而导致蛋白结构发生变化，影响其功能性质。
该研究发现，L-半胱氨酸能显著抑制大豆蛋白溶解度的下降，并对美拉德反应也有显著的抑制效应，同时也可能存在强还原作用，而槲皮素的添加并没有显著缓解溶解度降低的趋势且未能有效抑制美拉德反应。
参考文献
[1] 李玉珍，肖怀秋，兰立新.大豆分离蛋白功能特性及其在食品工业中的应用[J].中国食品添加剂，2008（1）：121-124.
[2] 田琨，管娟，邵正中，等.大豆分离蛋白结构与性能[J].化学进展，2008，20（4）：565-573.
[3] CHANG L Q，PIKAL M J.Mechanisms of protein stabilization in the solidstate[J].Journal of pharmaceutical science，2009，98（9）：2886-2908. [4] DAVIES C G A，NETTO F M，GLASSENAP N，et al.Indication of the Maillard reaction during storage of protein isolates[J].Journal of agricultural and food chemistry，1998，46（7）：2485-2489.
[5] WAGNER J R，SORGENTINI D A，AN M C.Relation between solubility and surface hydrophobicity as an indicator of modifications during preparation processes of commercial and laboratoryprepared soy protein isolates[J].Journal of agricultural and food chemistry，2000，48（8）：3159-3165.
[6] AJANDOUZ E H，TSCHIAPE L S，DALLE ORE F，et al.Effects of pH on caramelization and Maillard reaction kinetics in fructoselysine model systems[J].Journal of food science，2006，66（7）：926-931.
[7] MORALES F J，JIMNEZPREZ S.Free radical scavenging capacity of Maillard reaction products as related to colour and fluorescence[J].Food chemistry，2001，72（1）：119-125.
[8] SCAMAN C，NAKAI S，AMINLARI M.Effect of pH，temperature and sodium bisulfite or cysteine on the level of Maillardbased conjugation of lysozyme with dextran，galactomannan and mannan[J].Food chemistry，2006，99（2）：368-380.
[9] RAWEL H M，ROHN S，KROLL J.Influence of a sugar moiety（rhamnosylglucoside）at 3O position on the reactivity of quercetin with whey proteins[J].International journal of biological macromolecules，2003，32（3/4/5）：109-120.