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摘要[目的]探讨基因型、花粉发育时期对诱导胚状体的影响和胚状体形成过程中花粉粒的变化特性。[方法]以市场购买的“贼不偷”“大黄888”“中蔬四号”“黄香蕉”“顶心红”“粉宝莲”“宝石”7个番茄品种的花粉粒为材料，以B5为基本培养基，液体培养诱导胚状体。[结果]基因型是影响诱导胚状体的关键因素。供试的7个番茄品种中只有“贼不偷”品种的花粉粒对花粉培养有响应，其余品种无响应；花粉发育时期又是影响诱导胚状体的关键因素。“贼不偷”品种不同发育时期花粉粒对花粉培养的响应有差异，最佳时期是单核中期及单核靠边期；诱导出来的胚状体呈现带有胚柄、多细胞、球形或心形。[结论]试验结果为建立番茄游离小孢子培养体系及其相关机理研究提供了理论依据。
关键词 番茄；游离小孢子；培养；胚状体
中图分类号 S641.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）03-0013-03
Abstract[Objective] The aim was to study effects of genotype and pollen development period on induced embryoi and the change features of pollen grain in the formation process of embryoid.[Method] We took the pollen of “zeibutou”“dahuang888”“zhongshu4”“huangxiangjiao”“dingxinhong”“fenbaolian” “baoshi”varieties as materials，and cultured in B5 liqued medium to induce the embryoid.[Result] The genotype was one of the key factor influencing the inducing embryo.Only the pollens of “zeibutou” varieties effectively responsed to the pollen culture.The stage of pollen development was one another key factor influencing the inducing embryoid.The early and late uninuclear stages were the best stage for pollen culture.The induced embryoid displayed suspensorbearing，multicellular，global or heart shapes.[Conclusion] The results provide theoretical basis for establishing the pollen culture system and related mechanism research.
Key words Tomato；Isolated microspore；Culture；Embryoid
通過花粉培养可诱导单倍体和双单倍体（HD），这在植物的基础和应用研究中具有重要意义[1-2]，尤其是在作物育种中有重要的利用价值。由于双单倍体是100%的纯合体，通过1次体外培养便可获得双单倍体，节省成本和时间，极大地促进作物育种进程，可替代那些需通过连续自交和选择等传统的方法来培育纯合体的作物的育种进程，目前已在油菜、大麦、玉米、水稻、芦笋、胡椒、辣椒、茄子和小麦等[3]植物中广泛应用。
番茄是世界上广泛种植的蔬菜作物。然而与其重要的经济利用价值相比，花粉培养研究相对落后，至今尚未在番茄中建立其花粉培养体系，所以番茄的双单倍体未能在育种过程中广泛应用。自从1964年，Guha等[4]在曼佗罗中通过花药培养成功获得单倍体后，不久在番茄中有关于花药培养的研究[5-6]，之后的国内外关于番茄单倍体诱导的研究多集中在花药培养，如花药愈伤组织的诱导[7-12]、诱导根[13-14]、生长点的诱导[15-16]等方面，也有番茄再生植株的相关研究[17-19]。虽然也有通过番茄花粉培养诱导单倍体和双单倍体的相关研究报道[20-26]，但至今尚未见相关后续报道。长期以来，虽然人们围绕着番茄的花药和花粉培养进行了大量研究，但番茄单倍体诱导技术尚不成熟，特别是通过游离小孢子培养诱导双单倍体技术尚未形成完整体系。普遍认为番茄属于一种难诱导雄核发育的植物类型，建立番茄游离小孢子培养体系，诱导单倍体及双单倍体在番茄育种、植物单倍体发生机理及细胞全能性等基础性理论研究方面具有重要意义。鉴于此，笔者以7个番茄品种为材料，
探讨了基因型、花粉发育时期对诱导胚状体的影响和胚状体形成过程中花粉粒的变化特性，旨在为建立番茄游离小孢子培养体系及其相关机理研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 供试材料为从市场购买的“贼不偷”“大黄888”“中蔬四号”“黄香蕉”“顶心红”“粉宝莲”“宝石”7个番茄品种的种子，播种、育苗后移栽至温室大棚栽培，在盛花期采集的新鲜花蕾。温室栽培以自然光照为主，进行常规田间管理。
1.2 方法
1.2.1 花粉培养。盛花期采集7个供试番茄品种的新鲜花蕾，按花蕾长度分成6个等级（A：0～4 mm；B：4～6 mm；C：6～7 mm；D：7～8 mm；E：8～9 mm；F：9～11 mm），分别放入自封塑料袋中，4 ℃低温处理48 h，通过镜检，选择分别处于小孢子母细胞至二核期花粉粒的花蕾用纱布固定后用流水冲洗30 min，在无菌条件下用70%乙醇表面消毒30 s，用15% NaClO+2滴Tween-20消毒10 min，再用无菌水冲洗5～6次。消毒好的花蕾用镊子分离出花药后，在加有适量提取液（0.3 mol/L甘露醇）的研钵中研磨并分离出游离小孢子，50 μm细胞筛过滤，花粉粒收集在15 mL离心管中，800 r/min离心5 min，重复2次。向分离好的不同样品的不同发育时期的花粉粒中加适量B5液体培养基，用血球计数板计数，调节小孢子密度为2×104个/mL后，按2.5 mL/皿分裝在培养皿（60 mm×15 mm）中，25 ℃黑暗培养。 1.2.2 調查方法。在培养过程中，定期通过倒置显微镜观察游离小孢子的发育情况，每个培养皿观察500个小孢子，记录花粉粒不同发育时期诱导吸水膨大和启动分裂的小孢子百分率以及胚状体个数。将有变化的花粉粒和不同发育时期的胚状体从培养皿中分离出来，用卡宝品红染色后在光学显微镜下观察、拍照并做详细记录。
2 结果与分析
2.1 基因型对游离小孢子培养结果的影响
对很多植物的游离小孢子培养研究认为基因型对花粉培养效果有明显差异。为了筛选适合于花粉培养的番茄品种以及验证不同基因型番茄品种的花粉培养的响应，该研究以市场购买的“贼不偷”“大黄888”“中蔬四号”“黄香蕉”“顶心红”“粉宝莲”“宝石”7个番茄品种为材料，取其花粉粒，进行了花粉培养研究。结果除了“贼不偷”品种外，其他品种均未能观察到花粉粒形态变化以及胚状体的形成，由此推测番茄属于一种严重不响应花粉培养的植物类型。在完全相同的试验条件下，只有“贼不偷”品种的花粉粒在培养3 d开始观察到花粉粒膨大等变化，培养6 d后，核进一步分裂，形成明显的细胞壁，形成二、四细胞花粉粒，而花粉壁未破裂，有明显的胚柄状突起；培养10 d后开始形成不同形态的多细胞胚状体，不同形态胚状体均具有明显的胚柄（图1）。说明番茄花粉培养中存在不同基因型间差异，“贼不偷”品种是较适合番茄花粉培养研究的材料。
2.2 不同发育时期花粉粒的胚状体诱导效果
在植物花粉培养中，很多研究表明不同发育时期的花粉粒对花粉培养的响应有明显差异。虽然不同植物之间存在一定的差异，但普遍认为单核（中央或靠边）期是花粉培养的最佳时期。可以确定选择适宜发育时期的花粉粒进行培养是决定花粉培养成功的关键。鉴于二核期以后的花粉粒不能再转换其发育途径，该研究选择“贼不偷”品种的小孢子母细胞到二核花粉粒时期的花蕾进行了花粉培养研究。结果表明，不同发育时期花粉粒对花粉培养响应有明显差异（表1）。虽然小孢子母细胞时期的花粉粒中观察到启动核分裂的个别花粉粒，但启动核分裂以及形成胚柄状小突起，最终形成具胚柄的多细胞胚状体的均是单核（中央或靠边）期的花粉粒，其启动核分裂的小孢子率为0.6%～0.8%，诱导出胚状体的数量为2～4个/皿。
2.3 游离小孢子发育成胚状体过程中花粉粒的结构（形态）变化
“贼不偷”品种的单核（中央或靠边）期游离小孢子在B5液体培养基中培养3 d后，花粉粒开始膨大、核分裂（图1-B、C），其核物质的大小及染色程度判断属均等分裂。同时可观察到一般正常、未培养的花粉粒中观察不到的胚柄状小突起开始形成（图1-B、C中箭头指向部分）；培养6 d后，核进一步分裂，形成明显的细胞壁，形成二、四细胞型花粉粒（图1-D、E），此时花粉壁未破裂，2-4细胞仍包被在花粉壁中，胚柄状小突起变更大、更明显（图1-D、E中箭头指向部分）；培养10 d后可观察到形成球形（图1-F、G）、心形（图1-H）等不同形态的多细胞胚状体，此时不同形态胚状体均具有明显的胚柄（图1-F、G、H中箭头指向部分）。该种不同形态的胚状体继续培养时未能观察到明显的形态变化，基本保持原形。其他未启动核分裂的花粉粒在培养过程中始终保持原来正常花粉粒的形态，未能观察到形成细胞团或愈伤组织的现象，说明至少在该试验条件下，“贼不偷”品种的游离小孢子胚胎发育过程只有直接发育成胚状体这条途径。
3 结论与讨论
在为数不多的相关番茄花粉培养研究中，只有Seguí-Simarro等[27]对花粉培养诱导胚状体过程中花粉粒的动态变化进行了详细描述。他们利用NLN-13培养基培养6 d开始在液泡化的花粉粒中细胞核进行均等分裂后形成二核花粉粒；培养第1～7天开始出现四细胞的花粉粒；第10～14天开始出现第一个多细胞的具胚柄状胚状体（球形胚），之后胚状体不再有形态上的明显变化。这与该试验结果基本一致。由此可以推测，番茄的游离小孢子培养到胚状体的形成过程是属于不经愈伤组织的直接发育成胚状体的类型。
在Brassica napus L.花粉培养研究[28-31]中也有一些花粉粒（3～8个细胞期）中观察到胚柄的形成（单列的或不规则的多细胞突起），之后胚体进行横向分裂形成八核胚体和一串八核的胚柄，胚体再经细胞分裂逐渐变成具正常胚柄的球形、心形胚。认为胚柄的形成是小孢子获得细胞极性的标志。而进一步控制好热处理温度范围及更严格选择花粉发育时期时，就更容易诱导具有胚柄的胚状体，也可提高单倍体诱导率[32]。由此看来，花粉发育成具有胚柄的胚状体是在一些植物的花粉培养中时常发生的。花粉培养初期形成的胚柄状小突起能否作为番茄花粉粒获得胚性的标志，有待今后进一步研究观察。
Seguí-Simarro等[27]在番茄花粉培养中成功诱导出胚状体，然而至今尚未见成功诱导单倍体或双单倍体的后续报道。他们诱导的胚状体均具单列胚柄，这些胚柄末端仍被外模所包围。而该试验中观察到的胚柄均没有明显的外模，呈断裂状、不规则形状。这与张菊平[33]在辣椒中观察到的胚状体形狀极其相似。这种差异是否影响胚状体进一步发育成单倍体，需进一步研究验证。
参考文献
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关键词 番茄；游离小孢子；培养；胚状体
中图分类号 S641.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）03-0013-03
Abstract[Objective] The aim was to study effects of genotype and pollen development period on induced embryoi and the change features of pollen grain in the formation process of embryoid.[Method] We took the pollen of “zeibutou”“dahuang888”“zhongshu4”“huangxiangjiao”“dingxinhong”“fenbaolian” “baoshi”varieties as materials，and cultured in B5 liqued medium to induce the embryoid.[Result] The genotype was one of the key factor influencing the inducing embryo.Only the pollens of “zeibutou” varieties effectively responsed to the pollen culture.The stage of pollen development was one another key factor influencing the inducing embryoid.The early and late uninuclear stages were the best stage for pollen culture.The induced embryoid displayed suspensorbearing，multicellular，global or heart shapes.[Conclusion] The results provide theoretical basis for establishing the pollen culture system and related mechanism research.
Key words Tomato；Isolated microspore；Culture；Embryoid
通過花粉培养可诱导单倍体和双单倍体（HD），这在植物的基础和应用研究中具有重要意义[1-2]，尤其是在作物育种中有重要的利用价值。由于双单倍体是100%的纯合体，通过1次体外培养便可获得双单倍体，节省成本和时间，极大地促进作物育种进程，可替代那些需通过连续自交和选择等传统的方法来培育纯合体的作物的育种进程，目前已在油菜、大麦、玉米、水稻、芦笋、胡椒、辣椒、茄子和小麦等[3]植物中广泛应用。
番茄是世界上广泛种植的蔬菜作物。然而与其重要的经济利用价值相比，花粉培养研究相对落后，至今尚未在番茄中建立其花粉培养体系，所以番茄的双单倍体未能在育种过程中广泛应用。自从1964年，Guha等[4]在曼佗罗中通过花药培养成功获得单倍体后，不久在番茄中有关于花药培养的研究[5-6]，之后的国内外关于番茄单倍体诱导的研究多集中在花药培养，如花药愈伤组织的诱导[7-12]、诱导根[13-14]、生长点的诱导[15-16]等方面，也有番茄再生植株的相关研究[17-19]。虽然也有通过番茄花粉培养诱导单倍体和双单倍体的相关研究报道[20-26]，但至今尚未见相关后续报道。长期以来，虽然人们围绕着番茄的花药和花粉培养进行了大量研究，但番茄单倍体诱导技术尚不成熟，特别是通过游离小孢子培养诱导双单倍体技术尚未形成完整体系。普遍认为番茄属于一种难诱导雄核发育的植物类型，建立番茄游离小孢子培养体系，诱导单倍体及双单倍体在番茄育种、植物单倍体发生机理及细胞全能性等基础性理论研究方面具有重要意义。鉴于此，笔者以7个番茄品种为材料，
探讨了基因型、花粉发育时期对诱导胚状体的影响和胚状体形成过程中花粉粒的变化特性，旨在为建立番茄游离小孢子培养体系及其相关机理研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 供试材料为从市场购买的“贼不偷”“大黄888”“中蔬四号”“黄香蕉”“顶心红”“粉宝莲”“宝石”7个番茄品种的种子，播种、育苗后移栽至温室大棚栽培，在盛花期采集的新鲜花蕾。温室栽培以自然光照为主，进行常规田间管理。
1.2 方法
1.2.1 花粉培养。盛花期采集7个供试番茄品种的新鲜花蕾，按花蕾长度分成6个等级（A：0～4 mm；B：4～6 mm；C：6～7 mm；D：7～8 mm；E：8～9 mm；F：9～11 mm），分别放入自封塑料袋中，4 ℃低温处理48 h，通过镜检，选择分别处于小孢子母细胞至二核期花粉粒的花蕾用纱布固定后用流水冲洗30 min，在无菌条件下用70%乙醇表面消毒30 s，用15% NaClO+2滴Tween-20消毒10 min，再用无菌水冲洗5～6次。消毒好的花蕾用镊子分离出花药后，在加有适量提取液（0.3 mol/L甘露醇）的研钵中研磨并分离出游离小孢子，50 μm细胞筛过滤，花粉粒收集在15 mL离心管中，800 r/min离心5 min，重复2次。向分离好的不同样品的不同发育时期的花粉粒中加适量B5液体培养基，用血球计数板计数，调节小孢子密度为2×104个/mL后，按2.5 mL/皿分裝在培养皿（60 mm×15 mm）中，25 ℃黑暗培养。 1.2.2 調查方法。在培养过程中，定期通过倒置显微镜观察游离小孢子的发育情况，每个培养皿观察500个小孢子，记录花粉粒不同发育时期诱导吸水膨大和启动分裂的小孢子百分率以及胚状体个数。将有变化的花粉粒和不同发育时期的胚状体从培养皿中分离出来，用卡宝品红染色后在光学显微镜下观察、拍照并做详细记录。
2 结果与分析
2.1 基因型对游离小孢子培养结果的影响
对很多植物的游离小孢子培养研究认为基因型对花粉培养效果有明显差异。为了筛选适合于花粉培养的番茄品种以及验证不同基因型番茄品种的花粉培养的响应，该研究以市场购买的“贼不偷”“大黄888”“中蔬四号”“黄香蕉”“顶心红”“粉宝莲”“宝石”7个番茄品种为材料，取其花粉粒，进行了花粉培养研究。结果除了“贼不偷”品种外，其他品种均未能观察到花粉粒形态变化以及胚状体的形成，由此推测番茄属于一种严重不响应花粉培养的植物类型。在完全相同的试验条件下，只有“贼不偷”品种的花粉粒在培养3 d开始观察到花粉粒膨大等变化，培养6 d后，核进一步分裂，形成明显的细胞壁，形成二、四细胞花粉粒，而花粉壁未破裂，有明显的胚柄状突起；培养10 d后开始形成不同形态的多细胞胚状体，不同形态胚状体均具有明显的胚柄（图1）。说明番茄花粉培养中存在不同基因型间差异，“贼不偷”品种是较适合番茄花粉培养研究的材料。
2.2 不同发育时期花粉粒的胚状体诱导效果
在植物花粉培养中，很多研究表明不同发育时期的花粉粒对花粉培养的响应有明显差异。虽然不同植物之间存在一定的差异，但普遍认为单核（中央或靠边）期是花粉培养的最佳时期。可以确定选择适宜发育时期的花粉粒进行培养是决定花粉培养成功的关键。鉴于二核期以后的花粉粒不能再转换其发育途径，该研究选择“贼不偷”品种的小孢子母细胞到二核花粉粒时期的花蕾进行了花粉培养研究。结果表明，不同发育时期花粉粒对花粉培养响应有明显差异（表1）。虽然小孢子母细胞时期的花粉粒中观察到启动核分裂的个别花粉粒，但启动核分裂以及形成胚柄状小突起，最终形成具胚柄的多细胞胚状体的均是单核（中央或靠边）期的花粉粒，其启动核分裂的小孢子率为0.6%～0.8%，诱导出胚状体的数量为2～4个/皿。
2.3 游离小孢子发育成胚状体过程中花粉粒的结构（形态）变化
“贼不偷”品种的单核（中央或靠边）期游离小孢子在B5液体培养基中培养3 d后，花粉粒开始膨大、核分裂（图1-B、C），其核物质的大小及染色程度判断属均等分裂。同时可观察到一般正常、未培养的花粉粒中观察不到的胚柄状小突起开始形成（图1-B、C中箭头指向部分）；培养6 d后，核进一步分裂，形成明显的细胞壁，形成二、四细胞型花粉粒（图1-D、E），此时花粉壁未破裂，2-4细胞仍包被在花粉壁中，胚柄状小突起变更大、更明显（图1-D、E中箭头指向部分）；培养10 d后可观察到形成球形（图1-F、G）、心形（图1-H）等不同形态的多细胞胚状体，此时不同形态胚状体均具有明显的胚柄（图1-F、G、H中箭头指向部分）。该种不同形态的胚状体继续培养时未能观察到明显的形态变化，基本保持原形。其他未启动核分裂的花粉粒在培养过程中始终保持原来正常花粉粒的形态，未能观察到形成细胞团或愈伤组织的现象，说明至少在该试验条件下，“贼不偷”品种的游离小孢子胚胎发育过程只有直接发育成胚状体这条途径。
3 结论与讨论
在为数不多的相关番茄花粉培养研究中，只有Seguí-Simarro等[27]对花粉培养诱导胚状体过程中花粉粒的动态变化进行了详细描述。他们利用NLN-13培养基培养6 d开始在液泡化的花粉粒中细胞核进行均等分裂后形成二核花粉粒；培养第1～7天开始出现四细胞的花粉粒；第10～14天开始出现第一个多细胞的具胚柄状胚状体（球形胚），之后胚状体不再有形态上的明显变化。这与该试验结果基本一致。由此可以推测，番茄的游离小孢子培养到胚状体的形成过程是属于不经愈伤组织的直接发育成胚状体的类型。
在Brassica napus L.花粉培养研究[28-31]中也有一些花粉粒（3～8个细胞期）中观察到胚柄的形成（单列的或不规则的多细胞突起），之后胚体进行横向分裂形成八核胚体和一串八核的胚柄，胚体再经细胞分裂逐渐变成具正常胚柄的球形、心形胚。认为胚柄的形成是小孢子获得细胞极性的标志。而进一步控制好热处理温度范围及更严格选择花粉发育时期时，就更容易诱导具有胚柄的胚状体，也可提高单倍体诱导率[32]。由此看来，花粉发育成具有胚柄的胚状体是在一些植物的花粉培养中时常发生的。花粉培养初期形成的胚柄状小突起能否作为番茄花粉粒获得胚性的标志，有待今后进一步研究观察。
Seguí-Simarro等[27]在番茄花粉培养中成功诱导出胚状体，然而至今尚未见成功诱导单倍体或双单倍体的后续报道。他们诱导的胚状体均具单列胚柄，这些胚柄末端仍被外模所包围。而该试验中观察到的胚柄均没有明显的外模，呈断裂状、不规则形状。这与张菊平[33]在辣椒中观察到的胚状体形狀极其相似。这种差异是否影响胚状体进一步发育成单倍体，需进一步研究验证。
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