论文部分内容阅读
【摘要】 目的 建立高效阴离子交换色谱分离-脉冲安培检测法准确测定黄酒中的氨基酸含量。方法 采用了阴离子交换色谱法-积分脉冲安培检测法测定了黄酒五种不同品牌的酒中的氨基酸。结果 五种品牌黄酒的氨基酸平均含量是3155.15mg/L，其中氨基酸含量最高的为5203.00mg/L，氨基酸含量最低的为1224.58mg/L。结论 氨基酸是酒的营养成分及品质和品味的反映；原料和酿造方式的差异使酒中氨基酸含量与构成各不相同；利用阴离子交换色谱分离-脉冲安培检测法测定黄酒中的氨基酸，该方法样品前处理简单，方法适用性宽，测定重复性好，灵敏度高，定性定量准确，结果满意。
【关键词】 阴离子交换色谱法；积分脉冲安培检测；氨基酸；黄酒
文章编号：1004-7484（2013）-10-5447-03
黄酒是我国的民族特产，它历史悠久，其酿酒技术独树一帜，为东方酿造界的典型代表。黄酒以大米、黍米为原料，酒精含量14%-20%，属低度酿造酒。黄酒营养丰富，含有21种氨基酸及人体必需的8种氨其酸[1]。对酒中的氨基酸进行定性和定量分析是解析酒中的呈味氨基酸与黄酒的不同风味的最佳途径。但酒中氨基酸种类繁多、性质接近，目前常用的分析方法均存在一定不足。本研究采用高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法（HPAEC-IPAD）对黄酒中氨基酸进行检测[2-3]，样品前处理简单，方法适用性宽，测定重复性好，灵敏度高，定性定量准确，结果满意。
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
1.1.1 仪器 ICS-3000多功能色谱系统（Dionex，美国），包括双泵（DP）模块、自动淋洗发生装置（EG）模块、电化学安培检测器/色谱管理（DC）模块、AS50自动进样器（AS）模块。双泵模块中包含一个单元泵和一个GS50四元梯度泵，其中四元梯度泵用于氨基酸的分离；检测器/色谱模块中设置进样阀、分离柱和安培检测器，检测器用金工作电极，pH-Ag/AgCl参比电极，钛对电极，Xpress平板色谱工作站。
1.1.2 标准溶液 17种氨基酸标准物质，GBW（E）100062，（国家标准物质中心提供）。
1.1.3 试剂 氢氧化钠，乙酸钠，叠氮化钠（优级纯，北京化学试剂公司）。
1.2 溶液的制备
1.2.1 标准溶液 使用时将标准溶液用20mg/L叠氮化钠水溶液按要求稀释后使用。
1.2.2 NaOH淋洗液 取50%NaOH溶液20.0mL用去离子水稀释至1L，立即放在氮气环境中摇匀、保存。此溶液即为250mmol/LNaOH淋洗液。
1.2.3 NaAc淋洗液 称取82.0g固体乙酸钠，用经过0.25μm尼龙滤膜过滤后，用去离子水溶解并稀释至1L。此溶液即为1mol/L乙酸钠淋洗液，配制完毕后立即放在氮气环境中保存。
1.3 色谱条件 色谱柱：AminoPac PA10阴离子交换柱，包括分析柱（2×250mm）和保护柱（2×50mm）；淋洗条件：采用梯度洗脱；梯度淋洗程序：0min时淋洗液（%）H2O︰NaOH︰NaAc=93︰7︰0；然后H2O每分钟递减2.5%，NaOH每分钟递增2.5%，至25.0min时H2O︰NaOH︰NaAc=30︰70︰0；从25.0min开始至45.0min NaOH保持不变，H2O每分钟递减1%，NaAc每分钟递增1%，至45.0min时H2O︰NaOH︰NaAc=10︰70︰20，然后H2O保持不变，NaOH每分钟递减8%，NaAc每分钟递增8%，至50.0min时H2O︰NaOH︰NaAc=10︰30︰60，维持此百分比至60.0min分析结束。流速：0.25mL/min；检测条件：积分脉冲安培法检测；柱温：30℃；进样体积：25mL。
1.4 样品前处理 样品在分析前用去离子水按500倍数稀释后，经过0.35μm的滤膜过滤直接进样分析。
2 结果与讨论
2.1 色谱分离的检出限、线性范围及回收率 取17种氨基酸混合标准溶液，按1.3选定的色谱条件进样分析，得出了该方法的检出限、回归方程、相关系数及线性范围，同时我们还进行了各种氨基酸的样品加标回收率实验，见表1。
2.2 黄酒中氨基酸的分析 随意选取了市售的不同品牌的黄酒5份进行检测，以保留时间定性、外标法定量，见表2。
由表2可见，五种不同品牌的黄酒因原料及酿制方式不同，其氨基酸的含量差别很大，最高值5203.00mg/L，最低值1224.58mg/L。黄酒中的氨基酸的生成主要是曲霉菌的酸性蛋白霉和酸性羧肽酶对蒸煮后的原料米中的蛋白质分解而形成的，因此原料中蛋白质含量的不同及蛋白质转化率的高低是决定黄酒中氨基酸含量的主要因素，但不当勾兑也是造成氨基酸的含量较低的原因之一。
从分析结果还可以看出，以上五种黄酒中的呈味氨基酸以甜味氨基酸和苦味氨基酸的种类居多，它们的含量超过了80%。甜味氨基酸是米在曲酶的水解所产生的，同时在多种糖类物质的承托下赋予了黄酒滋润、丰满、浓厚的内质；黄酒中的鲜味来自多肽和含氮碱，为黄酒所特有；苦味氨基酸与发酵过程中产生的甲硫基腺苷和胺类等物质，给黄酒带来了恰到好处的苦味及特殊的风味，而让黄酒同时具有涩、苦两味主要由乳酸、酪氨酸、异丁醇和异戊醇等成分构成，苦、涩味适当，不但不会使酒呈明显的苦涩味，反而能使酒味有浓厚的柔和感[4]。因此准确分析黄酒中的氨基酸对研究氨基酸对黄酒风味的影响具有非常重要的意义。
3 结 论
氨基酸是各类酒的重要组成物质，在酒的口感和营养作用中扮演着重要的角色。长期以来，由于氨基酸的特殊性，其定量技术成为深入研究的难点。本研究利用不同氨基酸之间的在阴离子交换色谱的保留行为存在的差异，从而实现了用阴离子交换色谱-积分脉冲安培法分离、测定黄酒中的氨基酸。该检测方法样品前处理简单，只需对酒样进行简单的稀释和过滤，即可进行分析，操作方便，成本低，且方法适用性宽，测定重复性好，灵敏度高，定性定量准确，结果满意。这不仅大大提高了氨基酸分析的效率和能力，适用于大批量分析，而且为氨基酸的分析提供了一个可靠准确的方法。
从结果可以看出，黄酒主要氨基酸种类以甜味氨基酸和苦味氨基酸为主。不同品牌所用原料及酿造工艺的差异，其氨基酸的含量有所不同，含量最高为5203.00mg/L，最低为1224.58mg/L，相差近四点五倍；尽管氨基酸与黄酒的营养价值及口味、风味有很大的联系，但是黄酒的生产是一个复杂的体系，特别是不同类型的黄酒由于酿造的历史渊源、人文风情、社会背景、地理环境、原料质量、酿造工艺及管理水平的差异而产生巨大的变化，因此评价酒质的好坏需综合考虑多方面的因素。
参考文献
[1] 汪建国.黄酒中的色、香、味、体的构成和来源分析[J].中国酿造，2004，18（4）：6-10.
[2] Kaiser K，Benner R.Determination of Amino Sugars in Environmental samples with high salt content by high-performance anion-exchange chromatography and pulsed amperometric detection.Anal.Chem[J].2000，72：2566-2572.
[3] 于泓，丁永胜，牟世芬.阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法分离测定氨基酸注射液中的氨基酸和葡萄糖[J].色谱，2002，20（5）：398-404.
[4] 杨国军.黄酒中苦味物质及其来源探讨[J].酿酒，2003，30（3）：44-46.
【关键词】 阴离子交换色谱法；积分脉冲安培检测；氨基酸；黄酒
文章编号：1004-7484（2013）-10-5447-03
黄酒是我国的民族特产，它历史悠久，其酿酒技术独树一帜，为东方酿造界的典型代表。黄酒以大米、黍米为原料，酒精含量14%-20%，属低度酿造酒。黄酒营养丰富，含有21种氨基酸及人体必需的8种氨其酸[1]。对酒中的氨基酸进行定性和定量分析是解析酒中的呈味氨基酸与黄酒的不同风味的最佳途径。但酒中氨基酸种类繁多、性质接近，目前常用的分析方法均存在一定不足。本研究采用高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法（HPAEC-IPAD）对黄酒中氨基酸进行检测[2-3]，样品前处理简单，方法适用性宽，测定重复性好，灵敏度高，定性定量准确，结果满意。
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
1.1.1 仪器 ICS-3000多功能色谱系统（Dionex，美国），包括双泵（DP）模块、自动淋洗发生装置（EG）模块、电化学安培检测器/色谱管理（DC）模块、AS50自动进样器（AS）模块。双泵模块中包含一个单元泵和一个GS50四元梯度泵，其中四元梯度泵用于氨基酸的分离；检测器/色谱模块中设置进样阀、分离柱和安培检测器，检测器用金工作电极，pH-Ag/AgCl参比电极，钛对电极，Xpress平板色谱工作站。
1.1.2 标准溶液 17种氨基酸标准物质，GBW（E）100062，（国家标准物质中心提供）。
1.1.3 试剂 氢氧化钠，乙酸钠，叠氮化钠（优级纯，北京化学试剂公司）。
1.2 溶液的制备
1.2.1 标准溶液 使用时将标准溶液用20mg/L叠氮化钠水溶液按要求稀释后使用。
1.2.2 NaOH淋洗液 取50%NaOH溶液20.0mL用去离子水稀释至1L，立即放在氮气环境中摇匀、保存。此溶液即为250mmol/LNaOH淋洗液。
1.2.3 NaAc淋洗液 称取82.0g固体乙酸钠，用经过0.25μm尼龙滤膜过滤后，用去离子水溶解并稀释至1L。此溶液即为1mol/L乙酸钠淋洗液，配制完毕后立即放在氮气环境中保存。
1.3 色谱条件 色谱柱：AminoPac PA10阴离子交换柱，包括分析柱（2×250mm）和保护柱（2×50mm）；淋洗条件：采用梯度洗脱；梯度淋洗程序：0min时淋洗液（%）H2O︰NaOH︰NaAc=93︰7︰0；然后H2O每分钟递减2.5%，NaOH每分钟递增2.5%，至25.0min时H2O︰NaOH︰NaAc=30︰70︰0；从25.0min开始至45.0min NaOH保持不变，H2O每分钟递减1%，NaAc每分钟递增1%，至45.0min时H2O︰NaOH︰NaAc=10︰70︰20，然后H2O保持不变，NaOH每分钟递减8%，NaAc每分钟递增8%，至50.0min时H2O︰NaOH︰NaAc=10︰30︰60，维持此百分比至60.0min分析结束。流速：0.25mL/min；检测条件：积分脉冲安培法检测；柱温：30℃；进样体积：25mL。
1.4 样品前处理 样品在分析前用去离子水按500倍数稀释后，经过0.35μm的滤膜过滤直接进样分析。
2 结果与讨论
2.1 色谱分离的检出限、线性范围及回收率 取17种氨基酸混合标准溶液，按1.3选定的色谱条件进样分析，得出了该方法的检出限、回归方程、相关系数及线性范围，同时我们还进行了各种氨基酸的样品加标回收率实验，见表1。
2.2 黄酒中氨基酸的分析 随意选取了市售的不同品牌的黄酒5份进行检测，以保留时间定性、外标法定量，见表2。
由表2可见，五种不同品牌的黄酒因原料及酿制方式不同，其氨基酸的含量差别很大，最高值5203.00mg/L，最低值1224.58mg/L。黄酒中的氨基酸的生成主要是曲霉菌的酸性蛋白霉和酸性羧肽酶对蒸煮后的原料米中的蛋白质分解而形成的，因此原料中蛋白质含量的不同及蛋白质转化率的高低是决定黄酒中氨基酸含量的主要因素，但不当勾兑也是造成氨基酸的含量较低的原因之一。
从分析结果还可以看出，以上五种黄酒中的呈味氨基酸以甜味氨基酸和苦味氨基酸的种类居多，它们的含量超过了80%。甜味氨基酸是米在曲酶的水解所产生的，同时在多种糖类物质的承托下赋予了黄酒滋润、丰满、浓厚的内质；黄酒中的鲜味来自多肽和含氮碱，为黄酒所特有；苦味氨基酸与发酵过程中产生的甲硫基腺苷和胺类等物质，给黄酒带来了恰到好处的苦味及特殊的风味，而让黄酒同时具有涩、苦两味主要由乳酸、酪氨酸、异丁醇和异戊醇等成分构成，苦、涩味适当，不但不会使酒呈明显的苦涩味，反而能使酒味有浓厚的柔和感[4]。因此准确分析黄酒中的氨基酸对研究氨基酸对黄酒风味的影响具有非常重要的意义。
3 结 论
氨基酸是各类酒的重要组成物质，在酒的口感和营养作用中扮演着重要的角色。长期以来，由于氨基酸的特殊性，其定量技术成为深入研究的难点。本研究利用不同氨基酸之间的在阴离子交换色谱的保留行为存在的差异，从而实现了用阴离子交换色谱-积分脉冲安培法分离、测定黄酒中的氨基酸。该检测方法样品前处理简单，只需对酒样进行简单的稀释和过滤，即可进行分析，操作方便，成本低，且方法适用性宽，测定重复性好，灵敏度高，定性定量准确，结果满意。这不仅大大提高了氨基酸分析的效率和能力，适用于大批量分析，而且为氨基酸的分析提供了一个可靠准确的方法。
从结果可以看出，黄酒主要氨基酸种类以甜味氨基酸和苦味氨基酸为主。不同品牌所用原料及酿造工艺的差异，其氨基酸的含量有所不同，含量最高为5203.00mg/L，最低为1224.58mg/L，相差近四点五倍；尽管氨基酸与黄酒的营养价值及口味、风味有很大的联系，但是黄酒的生产是一个复杂的体系，特别是不同类型的黄酒由于酿造的历史渊源、人文风情、社会背景、地理环境、原料质量、酿造工艺及管理水平的差异而产生巨大的变化，因此评价酒质的好坏需综合考虑多方面的因素。
参考文献
[1] 汪建国.黄酒中的色、香、味、体的构成和来源分析[J].中国酿造，2004，18（4）：6-10.
[2] Kaiser K，Benner R.Determination of Amino Sugars in Environmental samples with high salt content by high-performance anion-exchange chromatography and pulsed amperometric detection.Anal.Chem[J].2000，72：2566-2572.
[3] 于泓，丁永胜，牟世芬.阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法分离测定氨基酸注射液中的氨基酸和葡萄糖[J].色谱，2002，20（5）：398-404.
[4] 杨国军.黄酒中苦味物质及其来源探讨[J].酿酒，2003，30（3）：44-46.