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摘要：目的 优选咽灵合剂的提取工艺。方法 采用L9（34）正交试验。以丹参酮ⅡA含量为评价指标，以醇用量、醇浓度和提取时间为考察因素，筛选咽灵合剂的最佳醇提条件；以丹参素钠、牛蒡苷和干膏率为评价指标，以加水量、煎煮次数和提取时间为考察因素，筛选咽灵合剂的最佳水提条件。结果 最佳醇提工艺为加6倍量80%乙醇，回流提取2次，每次1 h；最佳水提工艺为加6倍量水，煎煮3次，每次1 h。结论 本试验优选得到的咽灵合剂提取工艺稳定、可行。
关键词：咽灵合剂；正交试验；提取工艺
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.11.021
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）11-0054-03
咽灵合剂为成都中医药大学附属医院开发的医院制剂，该方由丹参、牛蒡子、玄参等8味中药组成，具有滋阴润燥、活血化瘀、散结利咽的功效，临床上用于治疗阴虚血瘀、邪毒滞留所致咽喉干燥、咽痛不适、咽内异物感等慢性咽炎症状。为便于服用及携带，遂将该方开发成质量稳定、适合服用的中成药。本试验以君药丹参中丹参酮ⅡA作为醇提工艺的考察指标，将醇提后的药渣与牛蒡子等药味混合水提，并将丹参素钠和臣药牛蒡子中的牛蒡苷含量作为水提工艺条件的考察指标，通过正交试验筛选提取工艺，从而为本制剂的规范化加工提供技术参数。 1 仪器与试药
AS10200超声清洗器（220 V，280 W，天津奥特赛恩斯仪器有限公司），BP211D电子分析天平（Sartorius，德国），SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），RE-S2C旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），HP-1100高效液相色谱仪（美国惠普），惠普四元梯度泵，惠普自动进样器，惠普柱温箱。
丹参酮ⅡA对照品（供含量测定用，批号110766-200619）、丹参素钠对照品（供含量测定用，批号110855-200809）、牛蒡苷对照品（供含量测定用，批号110819-201007）均购于中国药品生物制品检定所；丹参、牛蒡子、玄参等药材均购于四川新
通讯作者：宋英，Tel：028-87783735
荷花中药饮片股份有限公司；甲醇为色谱纯，水为蒸馏水，其余均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 醇提工艺正交试验
2.1.1 丹参酮ⅡA含量测定
2.1.1.1 色谱条件 色谱柱：Welchrom-C18（5 ?m，4.6 mm×250 mm）；流动相：甲醇-水（80∶20）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃[1-2]；检测波长：270 nm；理论板数按丹参酮ⅡA峰计不低于2 000。
2.1.1.2 线性关系考察 精密称取丹参酮ⅡA对照品0.004 26 g，加甲醇制成每1 mL含0.085 2 mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。精密吸取丹参酮ⅡA对照品溶液2、5、7、10、25 mL置25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀。按“2.1.1.1”项下色谱条件测定，以丹参酮ⅡA峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归。得回归方程：Y=53 287.81X-5.56（r=0.999 9）。结果表明，丹参酮ⅡA在0.068 16～0.852 ?g峰面积与进样量呈良好线性关系。
2.1.1.3 样品含量测定 精密吸取醇提工艺正交试验样品液2 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，取续滤2.1.2 因素水平的确定 根据预试结果及丹参药材的性质，以丹参酮ⅡA含量为考察指标，选定溶媒用量（A）、乙醇浓度（B）、提取时间（C）作为考察因素，提取次数取2次，因素水平见表1。
由表2的R值可知，影响提取效果的因素顺序为B>A>C。由表3可知，乙醇浓度（B）对提取效果有显著影响，溶媒用量（A）及提取时间（C）对提取效果无显著影响。根据正交试验结果，综合考虑实际生产，确立丹参醇提工艺为A1B3C1，即加入6倍量80%乙醇，回流提取2次，每次提取1 h。
2.1.4 醇提工艺验证试验 称取3 倍处方量药材，按最佳提取工艺分别制备3 批样品，结果表明，优选出的组合A1B3C1验证试验结果稳定，丹参酮ⅡA含量为1.307～1.383 mg/g。
2.2 水提工艺正交试验
2.2.1 丹参素钠含量测定
2.2.1.1 色谱条件 色谱柱：Welchrom-C18（5 ?m，4.6 mm×250 mm）；流动相：甲醇-0.5%乙酸（12∶88）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃[3-5]；检测波长：280 nm；理论板数按丹参素钠峰计算应不低于5 000。
2.2.1.2 线性关系考察 精密称取丹参素钠对照品0.030 26 g，加20%甲醇制成每1 mL含0.605 2 mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。精密吸取丹参素钠对照品溶液1、2、5、9、25 mL置25 mL量瓶中，加20%甲醇定容，摇匀，即得。按“2.2.1.1”项下色谱条件测定，以丹参素钠峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归。得回归方程：Y=5 337.57X+4.19（r=0.999 9）。结果表明，丹参素钠在0.242 08～6.052 ?g峰面积与进样量呈良好线性关系。
2.2.1.3 样品含量测定 精密吸取水提工艺正交试验样品液10 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，取续滤液，即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 ?L，注入液相色谱仪，测定，即得。色谱图见图2。
2.2.2 牛蒡苷含量测定
2.2.2.1 色谱条件 色谱柱：Welchrom-C18（5 ?m，4.6 mm×250 mm）；流动相：甲甲醇-水（45∶55）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃[6]；检测波长：280 nm；理论板数按牛蒡苷峰计算应不低于4 000。 2.2.2.2 线性关系范围的考察 精密称取牛蒡苷对照品0.017 82 g，加甲醇制成每1 mL含0.356 4 mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。精密吸取丹参素钠对照品溶液1、2、5、15、25 mL置25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。按“2.2.2.1”项下色谱条件测定，以牛蒡苷峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归。得回归方程：Y=5 718.3X-0.94（r=0.999 9）。结果表明，牛蒡苷在0.142 56～3.564 ?g峰面积与进样量呈良好线性关系。
2.2.2.3 样品含量测定 精密吸取水提工艺正交试验样品液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，取续滤液，即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 ?L，注入液相色谱仪，测定，即得。色谱图见图3。
2.2.3 因素水平的确定 根据预试验及处方药材性质，以丹参素钠含量、牛蒡苷含量为考察指标，选定加水量（A）、煎煮时间（B）、煎煮次数（C）作为考察因素，因素水平设计见表4。
2.2.4 水提工艺正交试验 按处方比例称取丹参药渣及牛蒡子等8味药材，按正交设计表L9（34）进行煎煮提取、过滤，合并滤液，滤液浓缩并定容至500 mL，即得样品液。精密吸取样品液20 mL，分别置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，残渣于105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，置于干燥器中冷却30 min，迅速称重，计算干膏收率。正交试验结果见表5，方差分析见表6。
由表5可知，影响水提效果的因素顺序依次为C>B>A。由方差分析结果可知，提取次数（C）对提取效果有显著影响，而煎煮时间（B）及加水量（A）对提取效果无显著影响。考虑到实际生产时缩短生产周期、降低生产成本等综合因素，确定咽灵合剂水提工艺为A1B1C3，即加6倍量水，提取3次，每次提取1 h。
2.2.5 水提工艺验证试验 结果表明，用优选的工艺条件提取，测得的丹参素钠、牛蒡苷含量及干膏率均较高，与正交试验结果相符，说明该工艺条件稳定可靠。见表7。
3 讨论
丹参为咽灵合剂中君药，根据丹参等药材所含成分理化性质的不同，有针对性地将提取工艺分为醇提和水提，使药材中的有效成分得以保留并发挥药效。采用正交试验，以丹参酮ⅡA的提取率为指标，优选醇提取工艺；以丹参素钠、牛蒡苷及出膏率为指标，优选水提工艺。
本研究分别对丹参素钠和牛蒡苷对照品及样品进行紫外扫描（200～410 nm），均在280 nm处有最大吸收，故选择280 nm作为检测波长。在丹参素钠的含量测定中，考察了3种不同的色谱条件。①色谱柱：Welchrom-C18（5 ?m， 4.6 mm×150 mm）；流动相：甲醇-0.5%乙酸（17∶83）；流速：1 mL/min，柱温25 ℃。②色谱柱：Welchrom-C18（5 ?m， 4.6 mm×150 mm）；流动相：甲醇-0.5%乙酸（7∶93）；流速：1 mL/min，柱温25 ℃。③色谱柱：Welchrom-C18（5 ?m， 4.6 mm×250 mm）；流动相：甲醇- 0.5%乙酸（12∶88）；流速为1 mL/min，柱温30 ℃。其中色谱条件①丹参素钠分离度较低，峰形较不对称；色谱条件②峰形对称性不理想且有干扰。试验结果表明，短柱对该样品中丹参素钠的分离效果不理想，长柱效果较好。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：71.
[2] 张玉祥，陈静君，陈优生.丹参提取工艺研究[J].中国中医药信息杂志， 2007，14（6）：50-51.
[3] 李井涛，杨晓腾，郭美玲.HPLC法测定止痛化症片和胶囊中丹参素钠的含量[J].中国药事，2011，25（6）：600-602.
[4] 黄衍民，黄炳亮，张亚斌，等.高效液相色谱法测定丹红注射液中丹参素钠的含量[J].中国医院药学杂志，2007，27（11）：1618-1619.
[5] 靖会，杨黎彬，边军昌，等.RP-HPLC法测定丹参不同部位中丹参素和原儿茶醛的含量[J].安徽医药，2011，15（6）：691-692.
[6] 郑莉，宋英.HPLC法测定羚羊感冒片中牛蒡苷的含量[J].中药与临床， 2011，2（2）：23-26.
（收稿日期：2012-05-29，编辑：陈静）
关键词：咽灵合剂；正交试验；提取工艺
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.11.021
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）11-0054-03
咽灵合剂为成都中医药大学附属医院开发的医院制剂，该方由丹参、牛蒡子、玄参等8味中药组成，具有滋阴润燥、活血化瘀、散结利咽的功效，临床上用于治疗阴虚血瘀、邪毒滞留所致咽喉干燥、咽痛不适、咽内异物感等慢性咽炎症状。为便于服用及携带，遂将该方开发成质量稳定、适合服用的中成药。本试验以君药丹参中丹参酮ⅡA作为醇提工艺的考察指标，将醇提后的药渣与牛蒡子等药味混合水提，并将丹参素钠和臣药牛蒡子中的牛蒡苷含量作为水提工艺条件的考察指标，通过正交试验筛选提取工艺，从而为本制剂的规范化加工提供技术参数。 1 仪器与试药
AS10200超声清洗器（220 V，280 W，天津奥特赛恩斯仪器有限公司），BP211D电子分析天平（Sartorius，德国），SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），RE-S2C旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），HP-1100高效液相色谱仪（美国惠普），惠普四元梯度泵，惠普自动进样器，惠普柱温箱。
丹参酮ⅡA对照品（供含量测定用，批号110766-200619）、丹参素钠对照品（供含量测定用，批号110855-200809）、牛蒡苷对照品（供含量测定用，批号110819-201007）均购于中国药品生物制品检定所；丹参、牛蒡子、玄参等药材均购于四川新
通讯作者：宋英，Tel：028-87783735
荷花中药饮片股份有限公司；甲醇为色谱纯，水为蒸馏水，其余均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 醇提工艺正交试验
2.1.1 丹参酮ⅡA含量测定
2.1.1.1 色谱条件 色谱柱：Welchrom-C18（5 ?m，4.6 mm×250 mm）；流动相：甲醇-水（80∶20）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃[1-2]；检测波长：270 nm；理论板数按丹参酮ⅡA峰计不低于2 000。
2.1.1.2 线性关系考察 精密称取丹参酮ⅡA对照品0.004 26 g，加甲醇制成每1 mL含0.085 2 mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。精密吸取丹参酮ⅡA对照品溶液2、5、7、10、25 mL置25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀。按“2.1.1.1”项下色谱条件测定，以丹参酮ⅡA峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归。得回归方程：Y=53 287.81X-5.56（r=0.999 9）。结果表明，丹参酮ⅡA在0.068 16～0.852 ?g峰面积与进样量呈良好线性关系。
2.1.1.3 样品含量测定 精密吸取醇提工艺正交试验样品液2 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，取续滤2.1.2 因素水平的确定 根据预试结果及丹参药材的性质，以丹参酮ⅡA含量为考察指标，选定溶媒用量（A）、乙醇浓度（B）、提取时间（C）作为考察因素，提取次数取2次，因素水平见表1。
由表2的R值可知，影响提取效果的因素顺序为B>A>C。由表3可知，乙醇浓度（B）对提取效果有显著影响，溶媒用量（A）及提取时间（C）对提取效果无显著影响。根据正交试验结果，综合考虑实际生产，确立丹参醇提工艺为A1B3C1，即加入6倍量80%乙醇，回流提取2次，每次提取1 h。
2.1.4 醇提工艺验证试验 称取3 倍处方量药材，按最佳提取工艺分别制备3 批样品，结果表明，优选出的组合A1B3C1验证试验结果稳定，丹参酮ⅡA含量为1.307～1.383 mg/g。
2.2 水提工艺正交试验
2.2.1 丹参素钠含量测定
2.2.1.1 色谱条件 色谱柱：Welchrom-C18（5 ?m，4.6 mm×250 mm）；流动相：甲醇-0.5%乙酸（12∶88）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃[3-5]；检测波长：280 nm；理论板数按丹参素钠峰计算应不低于5 000。
2.2.1.2 线性关系考察 精密称取丹参素钠对照品0.030 26 g，加20%甲醇制成每1 mL含0.605 2 mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。精密吸取丹参素钠对照品溶液1、2、5、9、25 mL置25 mL量瓶中，加20%甲醇定容，摇匀，即得。按“2.2.1.1”项下色谱条件测定，以丹参素钠峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归。得回归方程：Y=5 337.57X+4.19（r=0.999 9）。结果表明，丹参素钠在0.242 08～6.052 ?g峰面积与进样量呈良好线性关系。
2.2.1.3 样品含量测定 精密吸取水提工艺正交试验样品液10 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，取续滤液，即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 ?L，注入液相色谱仪，测定，即得。色谱图见图2。
2.2.2 牛蒡苷含量测定
2.2.2.1 色谱条件 色谱柱：Welchrom-C18（5 ?m，4.6 mm×250 mm）；流动相：甲甲醇-水（45∶55）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃[6]；检测波长：280 nm；理论板数按牛蒡苷峰计算应不低于4 000。 2.2.2.2 线性关系范围的考察 精密称取牛蒡苷对照品0.017 82 g，加甲醇制成每1 mL含0.356 4 mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。精密吸取丹参素钠对照品溶液1、2、5、15、25 mL置25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。按“2.2.2.1”项下色谱条件测定，以牛蒡苷峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归。得回归方程：Y=5 718.3X-0.94（r=0.999 9）。结果表明，牛蒡苷在0.142 56～3.564 ?g峰面积与进样量呈良好线性关系。
2.2.2.3 样品含量测定 精密吸取水提工艺正交试验样品液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，取续滤液，即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 ?L，注入液相色谱仪，测定，即得。色谱图见图3。
2.2.3 因素水平的确定 根据预试验及处方药材性质，以丹参素钠含量、牛蒡苷含量为考察指标，选定加水量（A）、煎煮时间（B）、煎煮次数（C）作为考察因素，因素水平设计见表4。
2.2.4 水提工艺正交试验 按处方比例称取丹参药渣及牛蒡子等8味药材，按正交设计表L9（34）进行煎煮提取、过滤，合并滤液，滤液浓缩并定容至500 mL，即得样品液。精密吸取样品液20 mL，分别置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，残渣于105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，置于干燥器中冷却30 min，迅速称重，计算干膏收率。正交试验结果见表5，方差分析见表6。
由表5可知，影响水提效果的因素顺序依次为C>B>A。由方差分析结果可知，提取次数（C）对提取效果有显著影响，而煎煮时间（B）及加水量（A）对提取效果无显著影响。考虑到实际生产时缩短生产周期、降低生产成本等综合因素，确定咽灵合剂水提工艺为A1B1C3，即加6倍量水，提取3次，每次提取1 h。
2.2.5 水提工艺验证试验 结果表明，用优选的工艺条件提取，测得的丹参素钠、牛蒡苷含量及干膏率均较高，与正交试验结果相符，说明该工艺条件稳定可靠。见表7。
3 讨论
丹参为咽灵合剂中君药，根据丹参等药材所含成分理化性质的不同，有针对性地将提取工艺分为醇提和水提，使药材中的有效成分得以保留并发挥药效。采用正交试验，以丹参酮ⅡA的提取率为指标，优选醇提取工艺；以丹参素钠、牛蒡苷及出膏率为指标，优选水提工艺。
本研究分别对丹参素钠和牛蒡苷对照品及样品进行紫外扫描（200～410 nm），均在280 nm处有最大吸收，故选择280 nm作为检测波长。在丹参素钠的含量测定中，考察了3种不同的色谱条件。①色谱柱：Welchrom-C18（5 ?m， 4.6 mm×150 mm）；流动相：甲醇-0.5%乙酸（17∶83）；流速：1 mL/min，柱温25 ℃。②色谱柱：Welchrom-C18（5 ?m， 4.6 mm×150 mm）；流动相：甲醇-0.5%乙酸（7∶93）；流速：1 mL/min，柱温25 ℃。③色谱柱：Welchrom-C18（5 ?m， 4.6 mm×250 mm）；流动相：甲醇- 0.5%乙酸（12∶88）；流速为1 mL/min，柱温30 ℃。其中色谱条件①丹参素钠分离度较低，峰形较不对称；色谱条件②峰形对称性不理想且有干扰。试验结果表明，短柱对该样品中丹参素钠的分离效果不理想，长柱效果较好。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：71.
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[5] 靖会，杨黎彬，边军昌，等.RP-HPLC法测定丹参不同部位中丹参素和原儿茶醛的含量[J].安徽医药，2011，15（6）：691-692.
[6] 郑莉，宋英.HPLC法测定羚羊感冒片中牛蒡苷的含量[J].中药与临床， 2011，2（2）：23-26.
（收稿日期：2012-05-29，编辑：陈静）