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【摘 要】对于某井水水样进行细菌总数指标检测，比较倾注法与涂布法地于检测结果的影响，以及比较不同的培养基对于细菌总数结果的影响。
【关键词】细菌总数;培养基;检测方法
水是微生物广泛分布的天然环境，无论是地表水还是地下水，甚至井水，都含有多种微生物。水的细菌学检查，间接判断水体污染状况和环境卫生学质量。水中微生物的含量是评价水质优劣的重要指标，作为日常检测的七项指标(色度、浊度、细菌总数、大肠菌群、余氯、铁、锰)之一的细菌总数，能非常直观地反映水被细菌污染的程度。
１．材料与实验1.1实验所需培养基与试剂1.1.1营养琼脂成分：蛋白胨（1%）、牛肉浸粉（0.3%）、氯化钠（0.5%）、琼脂（1.5%）1.1.2自养菌培养基成分：蛋白胨（1%）、牛肉浸粉（0.3%）、氯化钠（0.5%）、琼脂（1.5%）、硫化钠（1%）、硫酸镁（0.05%）、硫酸铵（0.4%）、硫酸亚铁（0.01%）、磷酸二氢钾（0.4%）、氯化钙（0.025%）1.1.3异养菌培养基成分：蛋白胨（1%）、牛肉浸粉（0.3%）、氯化钠（0.5%）、琼脂（1.5%）、硫酸镁（0.02%）、磷酸氢二钾（0.1%）、磷酸二氢铵（0.1%）、葡萄糖（0.05%）1.1.4混合培养基（自养加异养）成分：蛋白胨（1%）、牛肉浸粉（0.3%）、氯化钠（0.5%）、琼脂（1.5%）、硫化钠（1%）、硫酸镁（0.05%）、硫酸铵（0.4%）、硫酸亚铁（0.01%）、磷酸二氢钾（0.4%）、氯化钙（0.025%）、磷酸氢二钾（0.1%）、磷酸二氢铵（0.1%）、葡萄糖（0.05%）制法：分别将各培养基各成分混合后，加热溶解，调整PH为7.4～7.6，分装于玻璃容器中，经103.43KPa（121℃,15lb）灭菌20min，储存于冷暗处。1.2仪器1.2.1高压蒸汽灭菌器1.2.2培养箱1.2.3电炉1.2.4天平1.2.5 PH试纸1.2.6灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管、采样瓶1.2.7无菌L型玻璃棒1.3操作步骤1.3.1倾注法操作步骤以无菌操作方法用灭菌吸管分别吸取1号井水样、2号井水样1ml充分混匀的水样各4份，注入灭菌平皿中，分别倾注约15ml已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基、自养菌培养基、异养菌培养基、混合培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36±1℃培养箱内培养48小时及96小时，分别进行菌落计数，检测结果见表1。1.3.2涂布法操作步骤先将上述4种培养基各2份熔化后趁热倒入无菌平板中，然后用无菌吸管分别吸取1号井水样、2号井水样0.1ml接种在已凝固的培养基平板上。再用无菌L型玻璃棒将水样在平板上涂抹均匀，每个水样用一个无菌L型玻璃棒，将涂抹好的平板平放于桌上20~30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，使底面向上，置于36±1℃培养箱内培养48小时及96小时，分别进行菌落计数。从实验结果分析：（1）由1号培养基所培养的结果来看，涂布法明显比倾注法得到更多的细菌总数结果。（2）由2号培养基所培养的结果来看，涂布法培养的细菌明显多于倾注法多。（3）由3号培养基所培养的结果来看，涂布法与倾注法培养的结果明显增多，说明异养培养基培养较丰富，培养较多种类的细菌，所以结果增加。（4）由4号培养基所培养的结果来看，涂布法比倾注法培养的结果较多。（5）从培养时间上来看，48小时与96小时培养结果差别不大。（6）目前国标所用培养方法为倾注法，倾注法使好氧菌和兼性好氧菌与氧的接触少，所以使培养的结果偏低甚至需要延长培养时间来取得与涂布法相同的结果。（7）水样中自养菌数量明显低于异养菌；自养菌与混合培养基培养数量不如单独使用异养菌培养基所得结果，说明微生物之间具有拮抗作用，不能用单一培养基培养出所有种类的微生物；目前所使用的营养琼脂，但是由于培养基营养不够丰富，所以使检测结果偏低；
2.讨论（1）倾注法是将1mL水样加入平板内，再倒入融化的培养基，立即混匀，冷却凝固后倒置培养。其优点是：①通用；②较易使菌落均匀分布，计数容易；③取样量大，结果重现性好。倾注法缺点是：①该法不利于严格好氧菌的繁殖生长，分布在培养基内的部分细胞所形成的菌落较小，甚至无法形成菌落，②加上有些活菌受热损伤，使检测到的细菌总数偏低。涂布法是将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将0.1mL或0.2mL的样品悬液滴加在固体培养基表面，再用无菌玻璃涂棒将样品均匀分散至整个培养基表面，待样品被完全吸收后倒置培养。其优点是：①可以检测到热敏性菌体；②菌落生长在培养基表层，体积大，形态明显；③更适合严格的好氧菌。涂布法缺点是：①不易使菌落分布均匀，有时菌落过大，导致蔓延生长和互相融合，形成链状、片状涂布法菌落影响计数；②等待时间长，涂布棒用酒精火焰灼烧后，需放置数分钟等其完全冷却才能使用；③0.1～0.2mL水样涂布在固体培养基表面后需放置约10min等水样被渗透吸收后才能倒置，因此涂布法的使用并不广泛，只在特殊情况下使用。涂布法使好氧菌和兼性好氧菌与氧接触较多，使培养结果较准确；倾注法使好氧菌和兼性好氧菌与氧的接触少，使培养的结果偏低，所以涂布法较为理想的培养真实的细菌总数，但是涂布法操作较为麻烦。（2）用营养琼脂倾注法检测细菌总数，检测结果偏低，是由于营养琼脂营养不够丰富，不能培养较多种类的细菌，由此可看出没有一种培养基能够培养出水中所有的微生物，只能通过改变培养方法、分级分类培养基才能使水中菌落总数的指标更接近于直实值，从而反映出水中微生物的全貌。（3）细菌总数多寡反映水体有机物污染程度，检验意义极大。通过实验筛选出更灵敏的接种方法—双层培养法，优化稀释方法和培养基配方，可以最大限度促进活菌生长，得到比较全面的菌落总数，真实反映水体状况，为水质评价提供可靠依据。
【参考文献】
［１］中华人民共和国卫生部，卫生法制与监督司.生活饮用水卫生规范[S].2001.
［２］刘坚真，陈国寿，李海波，等.国家标准测定食品细菌总数培养基的改进研究[J].微生物学通报，2001，28(2)：63-68.
【关键词】细菌总数;培养基;检测方法
水是微生物广泛分布的天然环境，无论是地表水还是地下水，甚至井水，都含有多种微生物。水的细菌学检查，间接判断水体污染状况和环境卫生学质量。水中微生物的含量是评价水质优劣的重要指标，作为日常检测的七项指标(色度、浊度、细菌总数、大肠菌群、余氯、铁、锰)之一的细菌总数，能非常直观地反映水被细菌污染的程度。
１．材料与实验1.1实验所需培养基与试剂1.1.1营养琼脂成分：蛋白胨（1%）、牛肉浸粉（0.3%）、氯化钠（0.5%）、琼脂（1.5%）1.1.2自养菌培养基成分：蛋白胨（1%）、牛肉浸粉（0.3%）、氯化钠（0.5%）、琼脂（1.5%）、硫化钠（1%）、硫酸镁（0.05%）、硫酸铵（0.4%）、硫酸亚铁（0.01%）、磷酸二氢钾（0.4%）、氯化钙（0.025%）1.1.3异养菌培养基成分：蛋白胨（1%）、牛肉浸粉（0.3%）、氯化钠（0.5%）、琼脂（1.5%）、硫酸镁（0.02%）、磷酸氢二钾（0.1%）、磷酸二氢铵（0.1%）、葡萄糖（0.05%）1.1.4混合培养基（自养加异养）成分：蛋白胨（1%）、牛肉浸粉（0.3%）、氯化钠（0.5%）、琼脂（1.5%）、硫化钠（1%）、硫酸镁（0.05%）、硫酸铵（0.4%）、硫酸亚铁（0.01%）、磷酸二氢钾（0.4%）、氯化钙（0.025%）、磷酸氢二钾（0.1%）、磷酸二氢铵（0.1%）、葡萄糖（0.05%）制法：分别将各培养基各成分混合后，加热溶解，调整PH为7.4～7.6，分装于玻璃容器中，经103.43KPa（121℃,15lb）灭菌20min，储存于冷暗处。1.2仪器1.2.1高压蒸汽灭菌器1.2.2培养箱1.2.3电炉1.2.4天平1.2.5 PH试纸1.2.6灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管、采样瓶1.2.7无菌L型玻璃棒1.3操作步骤1.3.1倾注法操作步骤以无菌操作方法用灭菌吸管分别吸取1号井水样、2号井水样1ml充分混匀的水样各4份，注入灭菌平皿中，分别倾注约15ml已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基、自养菌培养基、异养菌培养基、混合培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36±1℃培养箱内培养48小时及96小时，分别进行菌落计数，检测结果见表1。1.3.2涂布法操作步骤先将上述4种培养基各2份熔化后趁热倒入无菌平板中，然后用无菌吸管分别吸取1号井水样、2号井水样0.1ml接种在已凝固的培养基平板上。再用无菌L型玻璃棒将水样在平板上涂抹均匀，每个水样用一个无菌L型玻璃棒，将涂抹好的平板平放于桌上20~30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，使底面向上，置于36±1℃培养箱内培养48小时及96小时，分别进行菌落计数。从实验结果分析：（1）由1号培养基所培养的结果来看，涂布法明显比倾注法得到更多的细菌总数结果。（2）由2号培养基所培养的结果来看，涂布法培养的细菌明显多于倾注法多。（3）由3号培养基所培养的结果来看，涂布法与倾注法培养的结果明显增多，说明异养培养基培养较丰富，培养较多种类的细菌，所以结果增加。（4）由4号培养基所培养的结果来看，涂布法比倾注法培养的结果较多。（5）从培养时间上来看，48小时与96小时培养结果差别不大。（6）目前国标所用培养方法为倾注法，倾注法使好氧菌和兼性好氧菌与氧的接触少，所以使培养的结果偏低甚至需要延长培养时间来取得与涂布法相同的结果。（7）水样中自养菌数量明显低于异养菌；自养菌与混合培养基培养数量不如单独使用异养菌培养基所得结果，说明微生物之间具有拮抗作用，不能用单一培养基培养出所有种类的微生物；目前所使用的营养琼脂，但是由于培养基营养不够丰富，所以使检测结果偏低；
2.讨论（1）倾注法是将1mL水样加入平板内，再倒入融化的培养基，立即混匀，冷却凝固后倒置培养。其优点是：①通用；②较易使菌落均匀分布，计数容易；③取样量大，结果重现性好。倾注法缺点是：①该法不利于严格好氧菌的繁殖生长，分布在培养基内的部分细胞所形成的菌落较小，甚至无法形成菌落，②加上有些活菌受热损伤，使检测到的细菌总数偏低。涂布法是将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将0.1mL或0.2mL的样品悬液滴加在固体培养基表面，再用无菌玻璃涂棒将样品均匀分散至整个培养基表面，待样品被完全吸收后倒置培养。其优点是：①可以检测到热敏性菌体；②菌落生长在培养基表层，体积大，形态明显；③更适合严格的好氧菌。涂布法缺点是：①不易使菌落分布均匀，有时菌落过大，导致蔓延生长和互相融合，形成链状、片状涂布法菌落影响计数；②等待时间长，涂布棒用酒精火焰灼烧后，需放置数分钟等其完全冷却才能使用；③0.1～0.2mL水样涂布在固体培养基表面后需放置约10min等水样被渗透吸收后才能倒置，因此涂布法的使用并不广泛，只在特殊情况下使用。涂布法使好氧菌和兼性好氧菌与氧接触较多，使培养结果较准确；倾注法使好氧菌和兼性好氧菌与氧的接触少，使培养的结果偏低，所以涂布法较为理想的培养真实的细菌总数，但是涂布法操作较为麻烦。（2）用营养琼脂倾注法检测细菌总数，检测结果偏低，是由于营养琼脂营养不够丰富，不能培养较多种类的细菌，由此可看出没有一种培养基能够培养出水中所有的微生物，只能通过改变培养方法、分级分类培养基才能使水中菌落总数的指标更接近于直实值，从而反映出水中微生物的全貌。（3）细菌总数多寡反映水体有机物污染程度，检验意义极大。通过实验筛选出更灵敏的接种方法—双层培养法，优化稀释方法和培养基配方，可以最大限度促进活菌生长，得到比较全面的菌落总数，真实反映水体状况，为水质评价提供可靠依据。
【参考文献】
［１］中华人民共和国卫生部，卫生法制与监督司.生活饮用水卫生规范[S].2001.
［２］刘坚真，陈国寿，李海波，等.国家标准测定食品细菌总数培养基的改进研究[J].微生物学通报，2001，28(2)：63-68.