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摘要 [目的]测定巨峰葡萄汁中的微量元素，探讨澄清工艺，为进一步开发广西巨峰葡萄的食用和药用价值提供参考，也为该品种葡萄汁工业化生产中澄清技术的突破提供基础材料。[方法]主要采用微波消解-电感耦合等离子体质谱技术测定巨峰葡萄原汁中13种人体必需微量元素，分别以果胶酶和明胶为澄清剂，透光率为主要评价指标，辅以可溶性固形物含量，设计L9（3.3）正交试验优化澄清工艺。[结果]巨峰葡萄原汁中尚未检出Se和I元素，Fe等11种元素标准方程均符合线性，R.2为0.996～1.000，Fe含量最高，为8.810 mg/L，Cu和Mn次之，分别为2.340、2.200 mg/L。澄清试验中，果胶酶用量0.01 g/L，酶解温度40 ℃，酶解时间60 min，在此条件下透光率为88.1%；明胶溶液浓度0.6 g/L，用量3 mL，作用时间120 min，可达最高透光率91.2%。[结论]巨峰葡萄汁可帮助人体补充必需微量元素，尤其是Fe、Cu、Mn和Zn等的良好来源，果胶酶和明胶均可起到良好的澄清效果。
关键词 巨峰葡萄；电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）；微量元素；果胶酶；明胶；可溶性固形物含量；透光率
中图分类号 TS255.54 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）23-0139-05
Abstract [Objective]The research aimed to detect the trace elements in Kyoho grape juice and discuss the clarification process， in order to offer reference to edible and medicinal value and provide the basis material to clarification technology of Kyoho grape in Guangxi.[Method] Microwave digestioninductively coupled plasma mass spectrometry was mainly used to determine 13 essential trace elements of human body in Kyoho grape juice. Pectinase and gelatin were considered as clarifiers， as well as translucent rate was used as the main evaluation index and soluble solid content as secondary index， so as to design L9（3.3） orthogonal test to optimize clarification process. [Result]Se and I had not been detected in Kyoho grape juice. Standard equations of other 11 elements such as Fe was linear whose R.2 ranged between 0.996 and 1.000. The content of Fe was highest，which was 8.810 mg/L；Cu and Mn followed with contents of 2.340 and 2.200 mg/L. Clarification test showed when pectin enzyme dosage was 0.01 g/L， enzymolysis temperature was 40 ℃ and time was 60 min， the translucent rate was 88.10%.When gelatin solution concentration was 0.6 g/L， dosage was 3 mL and time was 120 min， the highest translucent rate reached 91.2%.[Conclusion]Kyoho grape juice can help human body to supplement the essential trace elements， especially the good sources of Fe， Cu， Mn and Zn. Pectinase and gelatin can help to provide good clarification effect.
Key words Kyoho grape；Inductively coupled plasma mass spectrometry （ICP-MS）；Trace elements；Pectinase；Gelatin；Soluble solid content；Translucent rate
巨峰葡萄，原產日本，属中熟鲜食品种，1959年引入我国，因植株适应性强、抗病性良好，很快在我国各地推广栽培，在我国现有的葡萄品种中其栽培面积遥居全国之首[1-2]。南宁市地处广西南部地区，属亚热带季风气候，适宜葡萄生长，且一年两收技术得以突破[3-4]，巨峰产量大，果实着色好、品质优，是食品生产加工的优质原料，除鲜食外，常用于榨汁饮用。未发酵葡萄汁中含有丰富的功能性成分，具有防治贫血、肝炎、降低血脂和软化血管等医疗保健功效[5-7]，对慢性肾脏疾病患者的氧化DNA损伤具有保护作用[8]。
屈慧鸽[9]以小麦谷朊蛋白对霞多丽葡萄进行澄清效果研究，结果表明，小麦谷朊蛋白为500 mg/L时，葡萄汁澄清透亮，但可溶性固形物、色价、酸度均明显降低。阿衣满古力·哈力哈拜等[10]以和田红葡萄汁为原料，研究得到果胶酶澄清的最优条件为果胶酶0.4 g/L、酶解温度45 ℃、酶解时间150 min，可最大程度保留营养成分。Magrol等[11]以马尔贝克葡萄为原料，采用异丙醇固定化果胶酶-纤维素酶交联酶聚体，以降低葡萄汁浊度。Nadaroglu等[12]从片球菌M17中分离出一种甘露聚糖酶，经沉淀和离子交换纯化后用于澄清葡萄汁，得到当酶解时间为60 min、酶活为17 EU/L、温度为60 ℃时可达最高透光率84.65%。Aponso等[13]采用果胶酶澄清以色列蓝葡萄原浆，获得最优工艺为果胶酶2%、处理温度40 ℃、处理时间2 h，且果胶酶对蓝葡萄原浆理化性质的影响不显著。目前，尚缺乏巨峰品种葡萄汁含人体必须微量元素的系统性分析，对其适用于工业化生产的澄清工艺研究也较少，不利于广西区域性特色资源的开发利用。笔者主要采用微波消解-电感耦合等离子质谱法（ICP-MS）同时检测巨峰葡萄汁中多种微量元素，并分别探讨果胶酶与明胶的最优澄清工艺，为进一步开发广西巨峰葡萄的食用价值和药用价值提供参考，也为该品种葡萄汁工业化生产中安全、高效澄清技术的应用推广提供基础材料。 1 材料与方法
1.1 供试材料
巨峰葡萄采自广西壮族自治区南宁市明阳工业园区，葡萄原汁及调配汁由广西职业技术学院食品与生物技术系研制。
1.2 仪器和试剂
电感耦合等离子体质谱仪（7700型，美国Agilent公司）；原子荧光光谱计（AFS-8220型，北京吉天仪器有限公司）；微波消解仪（WX-6000型，上海屹尧仪器科技发展有限公司）；超声水浴锅（SCQ-Y300A型，上海声彥超声波仪器有限公司）；分析天平（BSA6202S-CW型，德国赛多利斯公司）；数星恒温水浴锅（HH-S6型，金坛市医疗仪器厂）；手持式折光仪（WYT型，成都豪创光电仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（UV-1800PC-DS2型，上海美普达仪器有限公司）；标准品Fe、Zn、Cu、Co、Mn、Cr、Ni、V、Mo、Sn均由北京世纪奥科生物技术有限公司提供；内标溶液.45Sc、.72Ge、.103Rh、.115In均由美国Agilent公司提供；氦气、氩气均由中山市鸿泰气体有限公司提供，纯度≥99.995%；盐酸、硝酸、无水乙醇、高氯酸、双氧水均由北京化工厂提供，优级纯；果胶酶由成都艾科达化学试剂有限公司提供，食品级；明胶由河南千志商贸有限公司，食品级。
1.3 试验方法
1.3.1 微量元素分析方法。
采用微波消解-电感耦合等离子质谱法同时测定巨峰葡萄原汁中的Fe、Zn、Cu、Co、Mn、Cr、
Ni、V、Mo、Sn元素，微波消解程序及ICP-MS工作参数分别如表1、表2所示；Se元素的测定应用双道原子荧光光谱法，仪器运行条件见表3；根据氟离子选择电极法测定样品中的F元素；I元素的测定采用氧化还原滴定法。
1.3.2 澄清工艺优化方法。
1.3.2.1 果胶酶对澄清效果的影响。
探讨果胶酶用量、酶解温度、酶解时间对巨峰葡萄调配汁澄清效果的影响，以样品透光率[14]为主要指标，并参考可溶性固形物含量[15]。在单因素试验的基础上，设计L9（3.3）正交试验，确定以果胶酶为澄清剂的最优澄清参数。正交试验水平和因素见表4。
1.3.2.2 明胶对澄清效果的影响。
分析明胶溶液浓度、添加量、作用时间对巨峰葡萄调配汁澄清效果的影响，以样品透光率为主要指标，并参考可溶性固形物含量。在单因素试验的基础上，设计L9（3.3）正交试验，确定以明胶为澄清剂的最适澄清工艺。正交试验水平和因素见表5。
1.4 数据分析 采用SPSS 16.0设计正交试验，并做显著性分析。测定结果均以3次平行试验的平均值表示。
2 结果与分析
2.1 巨峰葡萄原汁微量元素分析
巨峰葡萄原汁含人体必需13种微量元素的测定结果如表6所示。由此可知，尚未检出Se元素和I元素，其余Fe等11种元素的标准方程均符合线性，决定系数（R.2）为0.996～1.000，相关性良好，检出限（LOD）为0.016～12.492 μg/L，相对偏差（RSD）为0.561%～8.128%，均小于10%，符合国家标准[16]中的要求。在既定检测范围内，巨峰葡萄原汁中Fe含量最高，为8.810 mg/L；其次为Cu，含量为2.340 mg/L；含量在0.1～1.0 mg/L的元素包括Zn、F、Ni，依次为0.943、0.235、0.131 mg/L；Sn、Cr、Mo元素的检测值分别为0.064 6、0.054 7、0.029 7 mg/L；V元素和Co元素在巨峰葡萄原汁中的含量较低，分别为0.006 96和0.005 45 mg/L。可见，巨峰葡萄汁可帮助人体补充必需的微量元素，尤其是Fe、Cu、Mn和Zn等微量元素的良好来源。
2.2 巨峰葡萄调配汁澄清工艺分析
2.2.1 果胶酶对澄清效果的影响。
2.2.1.1 果胶酶用量的影响。
向试验样品中分别添加0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g/L的果膠酶，酶解温度设为40 ℃，酶解时间30 min，离心后测定上清液的透光率和可溶性固形物含量，结果见图1。从图1可以看出，透光率呈现上升、稳定、下降的总体趋势，并在0.01 g/L时达到最大透光率，为81.3%。当果胶酶用量为0.01 g/L时，可溶性固形物含量从2.9%降至2.2%，而后波动不大，保持在2.0%以上。
2.2.1.2 酶解温度的影响。
向试验样品中添加0.01 g/L果胶酶，设定酶解温度分别为30、40、50、60、70 ℃，酶解时间为30 min，离心后测定上清液的透光率和可溶性固形物含量，试验结果如图2所示。由图2可知，随着温度的升高，透光率呈现先缓慢上升后急剧下降的趋势，在50 ℃时达最高点，为82.5%。这是因为温度较低时，尚不能满足果胶酶对果胶质等物质的最优酶解作用，当温度进一步升高，超过酶反应的最适温度时，果胶酶的酶活性降低，酶解作用效果变差，导致透光率急剧下降。随着酶解温度的升高，可溶性固形物含量波动不明显，均保持在2.0%或以上。
2.2.1.3 酶解时间的影响。
向试验样品中添加0.01 g/L果胶酶，设定酶解温度为50 ℃，酶解时间分别设定为20、30、40、50、60 min，离心后测定上清液的透光率和可溶性固形物含量，结果见图3。从图3可以看出，酶解时间为20～50 min时，透光率随着时间的延长而逐渐上升，50 min时达最高点，为82.4%，继续延长时间，透光率不再上升。可溶性固形物含量发生微小变化，试验中均保持在2.5%或以上。
2.2.1.4 正交试验。
表7为果胶酶对澄清效果影响的正交试验结果。由此可得，试验的最优组合为A1B2C3，即果胶酶用量为0.01 g/L，酶解温度为40 ℃，酶解时间为60 min时，可达到最优的澄清效果。由极差分析可知，影响葡萄汁澄清效果因素的主次排序为A、C、B，即果胶酶用量的影响最大，其次是酶解时间，最后是酶解温度。由显著性分析可知，果胶酶用量对澄清效果的影响显著（Sig.=0.03<0.05），酶解温度（Sig.=0.59）、酶解时间（Sig.=0.42）的影响均不显著。 2.2.1.5 验证试验。
由于所得最优组合的条件在正交的9组试验中并未涉及，需进行验证试验。试验所得葡萄汁透光率为88.1%，可溶性固形物含量为2.4%，透光率高于以上9组试验的结果，表明所得最优组合正确。
2.2.2 明胶对澄清效果的影响。
2.2.2.1 明胶溶液浓度的影响。
分别向试验样品中添加浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的明胶溶液，常温下保持40 min，离心后分别测定上清液的透光率、可溶性固性含量，结果如图4所示。试验过程中发现，添加明胶溶液后，出现雾浊现象，有絮状物生成，并收缩成网状沉淀物沉淀到容器底部。从图4可以看出，明胶溶液浓度在0～0.4 g/L时，随着浓度的增加，透光率呈现上升趋势，当浓度达0.4 g/L时，透光率最大，为80.7%，浓度继续增大时透光率不再上升反而下降。可溶性固形物含量则随着明胶溶液浓度的增大呈现先下降后稳定的趋势，且下降幅度不大。
2.2.2.2 添加量的影响。
向试验样品中添加0.4 g/L明胶溶液体积分别为0、1、2、3、4、5、6 mL，常温下保持40 min，离心后分别测定上清液的透光率和可溶性固性含量，结果见图5。由图5可知，随着添加量上升，透光率呈现先上升后下降的趋势，并在添加量为3 mL时达到最大，为83.2%。可溶性固形物含量变化不明显，均在2%左右波动。
2.2.2.3 作用时间的影响。
向试验样品中投入3 mL浓度为0.4 g/L的明胶溶液，常温下作用时间分别设定为30、60、90、120、150 min，离心后分别测定上清液的透光率和可溶性固性含量，结果如图6所示。从图6可以看出，当作用时间为30～90 min时，透光率显著提高，90 min时达到最大透光率，为85.4%，作用时间继续延长，透光率出现一定程度下降，随后保持平稳。可溶性固形物含量变化微小，波动不大。
2.2.2.4 正交试验。
以明胶作为澄清剂，优化澄清工艺的正交试验结果见表8。从表8可以得出，最优组合为A3B3C2，即明胶溶液浓度为0.6 g/L，添加量为3 mL，作用时间为120 min。由极差分析可知，各因素对透光率影响主次顺序为A、B、C，即明胶溶液浓度的影响最大，其次是添加量，作用时间的影响最小。可溶性固形物含量在正交试验中差异不大，较为稳定。以透光率为指标，对正交试验结果进行方差分析。结果表明，3个因素中，仅明胶溶液浓度对透光率有显著性影响（Sig.=0.03<0.05），添加量（Sig.=0.26）、作用时间（Sig.=0.53）的影响则不显著。
2.2.2.5 验证试验。以正交试验得到的最优组合进行验证试验。试验所得透光率为91.2%，可溶性固形物含量为1.8%，与正交试验表中第9组试验的结果不存在显著性差异，且均高于其他8组试验的结果。这表明正交试验结果较为稳定，最优组合正确。
3 结论与讨论
微量元素是人体必需的营养成分，也是巨峰葡萄汁保健功能的重要因素之一。由ICP-MS技术测得巨峰葡萄汁中Fe、Cu、Mn、Zn含量较高，分别为8.810、2.340、2.200、0.943 mg/L。Fe可促进血红蛋白合成，有助于机体中氧的运输；Cu的主要功能为辅助造血，可促进血红蛋白中Fe的合成，促进Fe的吸收，是乳糖酶、酪氨酸酶、超氧化物歧化酶（SOD）重要的组成元素，参与多种代谢反应；Mn可帮助人体形成连接组织、骨骼、凝血因子和性激素，在脂质和糖类代谢、钙吸收和血糖调控中也扮演着十分重要的角色；Zn参与人体中蛋白质、糖类、脂质和能量的代谢，有助于保持人体皮肤健康，对生长发育、提高人体免疫力、抵御疾病具有非常重要的意義。巨峰葡萄汁可帮助人体补充必需的微量元素，尤其是Fe、Cu、Mn和Zn等的良好来源。
结合单因素和正交试验，得到最优澄清工艺为果胶酶用量0.01 g/L、酶解温度40 ℃、酶解时间60 min，透光率为88.1%，可溶性固形物含量为2.4%；或明胶溶液浓度0.6 g/L、添加量3 mL、作用时间120 min，透光率为91.2%，可溶性固形物含量为1.8%。明胶是一种亲水性胶体，可吸附葡萄汁中导致浑浊的酚类物质、金属离子和可溶性蛋白质等，从而发生絮凝反应，沉淀下来，以提高澄清效果。果胶酶与明胶均为良好的澄清剂，既可提高澄清度又可维持可溶性固形物含量，对样品性质影响不大，结合单因素试验和正交试验优化得到澄清工艺简单、高效、安全、可行，该参数可在巨峰葡萄汁工业化生产中应用。果胶酶和明胶的交联作用及生产应用推广将成为下一步研究的重点。
参考文献
[1]杨晓帆，高媛，韩梅梅，等.云南高原区酿酒葡萄果实香气物质的积累规律[J].中国农业科学， 2014，47（12）：2405-2416.
[2] 刘崇怀，姜建福，樊秀彩，等.中国野生葡萄资源在生产和育种中利用的概况[J].植物遗传资源学报，2014，15（4）：720-727.
[3] 黄江流，韦令，覃祖猛，等.广西中部巨峰葡萄栽培气候适宜度及其一年两收栽培技术要点[J].南方农业学报，2011，42（7）：774-778.
[4] 何建军，王博，陈爱军，等.广西不同生态区域葡萄一年两收栽培区划研究[J].南方园艺，2016，27（5）：6-8.
[5] TIWARI B K， PATRAS A，BRUNTON N，et al.Effect of ultrasound processing on anthocyanins and color of red grape juice[J].Ultrasonics sonochemistry，2010，17（3）：598-604. [6] CASTILLA P，DVALOS A，TERUEL J L，et al.Comparative effects of dietary supplementation with red grape juice and vitamin E on production of superoxide by circulating neutrophil NADPH oxidase in hemodialysis patients[J]. American journal of clinical nutrition，2008，87（4）：1053-1061.
[7] BED T P，MATTOSO V，PASCOAL A C，et al.Effect of grape juice consumption and red wine in the osteoprotegerin level and systolic blood pressure in rats wistar fed high-fat diet[J].International journal of food sciences and nutrition，2016，5（3）：170-174.
[8] MAION C，DE PAULA E S，GALLIMBERTI M，et al.Comparative study of data mining techniques for the authentication of organic grape juice based on ICPMS analysis[J].Expert systems with applications，2016，49：60-73.
[9] 屈慧鸽.小麦谷朊蛋白对霞多丽葡萄汁澄清效果的研究[J].食品科学，2008，29（11）：210-212.
[10] 阿衣满古力·哈力哈拜，朱璇，热合满·艾拉.果胶酶澄清和田红葡萄汁工艺研究[J].新疆农业科学，2010，47（6）：1102-1106.
[11] MAGRO L D，HERTZ P F，FERNANDEZ-LAFUENTE R，et al.Preparation and characterization of a CombiCLEAs from pectinases and cellulases：A potential biocatalyst for grape juice clarification[J].RSC Advances，2016，32（6）：27242-27251.
[12] NADAROGLU H，ADIGUZEL G，ADIGUZEL A，et al.A thermostableendoβ（1，4）mannanase from Pediococcus acidilactici （M17）：Purification， characterization and its application in fruit juice clarification[J].European food research and technology，2017，243（2）：193-201.
[13] APONSO M，MARAPANA U，MANAWADUGE R.Process optimization of pectinase enzyme aided clarification of Israel blue （Vitis vinifera L.） grape juice[J].European journal of academic essays， 2017，4（4）：165-174.
[14] DIBLAN S，TURKYILMAZ M，OZKAN M.Effects of various clarification agents on the anthocyanins and color of red grape juice from Kalecik Karasi grapes （Vitis vinifera L）[J].Food processing and technology，2015，6（8）：104-108.
[15] CAC.Codesgeneral standard for fruit juices and nectars：Codex Stan 247—2005[S].CAC，2005.
[16] 中華人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品中多元素的测定：GB 5009.268—2016[S].北京：中国标准出版社，2016：1-5.
关键词 巨峰葡萄；电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）；微量元素；果胶酶；明胶；可溶性固形物含量；透光率
中图分类号 TS255.54 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）23-0139-05
Abstract [Objective]The research aimed to detect the trace elements in Kyoho grape juice and discuss the clarification process， in order to offer reference to edible and medicinal value and provide the basis material to clarification technology of Kyoho grape in Guangxi.[Method] Microwave digestioninductively coupled plasma mass spectrometry was mainly used to determine 13 essential trace elements of human body in Kyoho grape juice. Pectinase and gelatin were considered as clarifiers， as well as translucent rate was used as the main evaluation index and soluble solid content as secondary index， so as to design L9（3.3） orthogonal test to optimize clarification process. [Result]Se and I had not been detected in Kyoho grape juice. Standard equations of other 11 elements such as Fe was linear whose R.2 ranged between 0.996 and 1.000. The content of Fe was highest，which was 8.810 mg/L；Cu and Mn followed with contents of 2.340 and 2.200 mg/L. Clarification test showed when pectin enzyme dosage was 0.01 g/L， enzymolysis temperature was 40 ℃ and time was 60 min， the translucent rate was 88.10%.When gelatin solution concentration was 0.6 g/L， dosage was 3 mL and time was 120 min， the highest translucent rate reached 91.2%.[Conclusion]Kyoho grape juice can help human body to supplement the essential trace elements， especially the good sources of Fe， Cu， Mn and Zn. Pectinase and gelatin can help to provide good clarification effect.
Key words Kyoho grape；Inductively coupled plasma mass spectrometry （ICP-MS）；Trace elements；Pectinase；Gelatin；Soluble solid content；Translucent rate
巨峰葡萄，原產日本，属中熟鲜食品种，1959年引入我国，因植株适应性强、抗病性良好，很快在我国各地推广栽培，在我国现有的葡萄品种中其栽培面积遥居全国之首[1-2]。南宁市地处广西南部地区，属亚热带季风气候，适宜葡萄生长，且一年两收技术得以突破[3-4]，巨峰产量大，果实着色好、品质优，是食品生产加工的优质原料，除鲜食外，常用于榨汁饮用。未发酵葡萄汁中含有丰富的功能性成分，具有防治贫血、肝炎、降低血脂和软化血管等医疗保健功效[5-7]，对慢性肾脏疾病患者的氧化DNA损伤具有保护作用[8]。
屈慧鸽[9]以小麦谷朊蛋白对霞多丽葡萄进行澄清效果研究，结果表明，小麦谷朊蛋白为500 mg/L时，葡萄汁澄清透亮，但可溶性固形物、色价、酸度均明显降低。阿衣满古力·哈力哈拜等[10]以和田红葡萄汁为原料，研究得到果胶酶澄清的最优条件为果胶酶0.4 g/L、酶解温度45 ℃、酶解时间150 min，可最大程度保留营养成分。Magrol等[11]以马尔贝克葡萄为原料，采用异丙醇固定化果胶酶-纤维素酶交联酶聚体，以降低葡萄汁浊度。Nadaroglu等[12]从片球菌M17中分离出一种甘露聚糖酶，经沉淀和离子交换纯化后用于澄清葡萄汁，得到当酶解时间为60 min、酶活为17 EU/L、温度为60 ℃时可达最高透光率84.65%。Aponso等[13]采用果胶酶澄清以色列蓝葡萄原浆，获得最优工艺为果胶酶2%、处理温度40 ℃、处理时间2 h，且果胶酶对蓝葡萄原浆理化性质的影响不显著。目前，尚缺乏巨峰品种葡萄汁含人体必须微量元素的系统性分析，对其适用于工业化生产的澄清工艺研究也较少，不利于广西区域性特色资源的开发利用。笔者主要采用微波消解-电感耦合等离子质谱法（ICP-MS）同时检测巨峰葡萄汁中多种微量元素，并分别探讨果胶酶与明胶的最优澄清工艺，为进一步开发广西巨峰葡萄的食用价值和药用价值提供参考，也为该品种葡萄汁工业化生产中安全、高效澄清技术的应用推广提供基础材料。 1 材料与方法
1.1 供试材料
巨峰葡萄采自广西壮族自治区南宁市明阳工业园区，葡萄原汁及调配汁由广西职业技术学院食品与生物技术系研制。
1.2 仪器和试剂
电感耦合等离子体质谱仪（7700型，美国Agilent公司）；原子荧光光谱计（AFS-8220型，北京吉天仪器有限公司）；微波消解仪（WX-6000型，上海屹尧仪器科技发展有限公司）；超声水浴锅（SCQ-Y300A型，上海声彥超声波仪器有限公司）；分析天平（BSA6202S-CW型，德国赛多利斯公司）；数星恒温水浴锅（HH-S6型，金坛市医疗仪器厂）；手持式折光仪（WYT型，成都豪创光电仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（UV-1800PC-DS2型，上海美普达仪器有限公司）；标准品Fe、Zn、Cu、Co、Mn、Cr、Ni、V、Mo、Sn均由北京世纪奥科生物技术有限公司提供；内标溶液.45Sc、.72Ge、.103Rh、.115In均由美国Agilent公司提供；氦气、氩气均由中山市鸿泰气体有限公司提供，纯度≥99.995%；盐酸、硝酸、无水乙醇、高氯酸、双氧水均由北京化工厂提供，优级纯；果胶酶由成都艾科达化学试剂有限公司提供，食品级；明胶由河南千志商贸有限公司，食品级。
1.3 试验方法
1.3.1 微量元素分析方法。
采用微波消解-电感耦合等离子质谱法同时测定巨峰葡萄原汁中的Fe、Zn、Cu、Co、Mn、Cr、
Ni、V、Mo、Sn元素，微波消解程序及ICP-MS工作参数分别如表1、表2所示；Se元素的测定应用双道原子荧光光谱法，仪器运行条件见表3；根据氟离子选择电极法测定样品中的F元素；I元素的测定采用氧化还原滴定法。
1.3.2 澄清工艺优化方法。
1.3.2.1 果胶酶对澄清效果的影响。
探讨果胶酶用量、酶解温度、酶解时间对巨峰葡萄调配汁澄清效果的影响，以样品透光率[14]为主要指标，并参考可溶性固形物含量[15]。在单因素试验的基础上，设计L9（3.3）正交试验，确定以果胶酶为澄清剂的最优澄清参数。正交试验水平和因素见表4。
1.3.2.2 明胶对澄清效果的影响。
分析明胶溶液浓度、添加量、作用时间对巨峰葡萄调配汁澄清效果的影响，以样品透光率为主要指标，并参考可溶性固形物含量。在单因素试验的基础上，设计L9（3.3）正交试验，确定以明胶为澄清剂的最适澄清工艺。正交试验水平和因素见表5。
1.4 数据分析 采用SPSS 16.0设计正交试验，并做显著性分析。测定结果均以3次平行试验的平均值表示。
2 结果与分析
2.1 巨峰葡萄原汁微量元素分析
巨峰葡萄原汁含人体必需13种微量元素的测定结果如表6所示。由此可知，尚未检出Se元素和I元素，其余Fe等11种元素的标准方程均符合线性，决定系数（R.2）为0.996～1.000，相关性良好，检出限（LOD）为0.016～12.492 μg/L，相对偏差（RSD）为0.561%～8.128%，均小于10%，符合国家标准[16]中的要求。在既定检测范围内，巨峰葡萄原汁中Fe含量最高，为8.810 mg/L；其次为Cu，含量为2.340 mg/L；含量在0.1～1.0 mg/L的元素包括Zn、F、Ni，依次为0.943、0.235、0.131 mg/L；Sn、Cr、Mo元素的检测值分别为0.064 6、0.054 7、0.029 7 mg/L；V元素和Co元素在巨峰葡萄原汁中的含量较低，分别为0.006 96和0.005 45 mg/L。可见，巨峰葡萄汁可帮助人体补充必需的微量元素，尤其是Fe、Cu、Mn和Zn等微量元素的良好来源。
2.2 巨峰葡萄调配汁澄清工艺分析
2.2.1 果胶酶对澄清效果的影响。
2.2.1.1 果胶酶用量的影响。
向试验样品中分别添加0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g/L的果膠酶，酶解温度设为40 ℃，酶解时间30 min，离心后测定上清液的透光率和可溶性固形物含量，结果见图1。从图1可以看出，透光率呈现上升、稳定、下降的总体趋势，并在0.01 g/L时达到最大透光率，为81.3%。当果胶酶用量为0.01 g/L时，可溶性固形物含量从2.9%降至2.2%，而后波动不大，保持在2.0%以上。
2.2.1.2 酶解温度的影响。
向试验样品中添加0.01 g/L果胶酶，设定酶解温度分别为30、40、50、60、70 ℃，酶解时间为30 min，离心后测定上清液的透光率和可溶性固形物含量，试验结果如图2所示。由图2可知，随着温度的升高，透光率呈现先缓慢上升后急剧下降的趋势，在50 ℃时达最高点，为82.5%。这是因为温度较低时，尚不能满足果胶酶对果胶质等物质的最优酶解作用，当温度进一步升高，超过酶反应的最适温度时，果胶酶的酶活性降低，酶解作用效果变差，导致透光率急剧下降。随着酶解温度的升高，可溶性固形物含量波动不明显，均保持在2.0%或以上。
2.2.1.3 酶解时间的影响。
向试验样品中添加0.01 g/L果胶酶，设定酶解温度为50 ℃，酶解时间分别设定为20、30、40、50、60 min，离心后测定上清液的透光率和可溶性固形物含量，结果见图3。从图3可以看出，酶解时间为20～50 min时，透光率随着时间的延长而逐渐上升，50 min时达最高点，为82.4%，继续延长时间，透光率不再上升。可溶性固形物含量发生微小变化，试验中均保持在2.5%或以上。
2.2.1.4 正交试验。
表7为果胶酶对澄清效果影响的正交试验结果。由此可得，试验的最优组合为A1B2C3，即果胶酶用量为0.01 g/L，酶解温度为40 ℃，酶解时间为60 min时，可达到最优的澄清效果。由极差分析可知，影响葡萄汁澄清效果因素的主次排序为A、C、B，即果胶酶用量的影响最大，其次是酶解时间，最后是酶解温度。由显著性分析可知，果胶酶用量对澄清效果的影响显著（Sig.=0.03<0.05），酶解温度（Sig.=0.59）、酶解时间（Sig.=0.42）的影响均不显著。 2.2.1.5 验证试验。
由于所得最优组合的条件在正交的9组试验中并未涉及，需进行验证试验。试验所得葡萄汁透光率为88.1%，可溶性固形物含量为2.4%，透光率高于以上9组试验的结果，表明所得最优组合正确。
2.2.2 明胶对澄清效果的影响。
2.2.2.1 明胶溶液浓度的影响。
分别向试验样品中添加浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的明胶溶液，常温下保持40 min，离心后分别测定上清液的透光率、可溶性固性含量，结果如图4所示。试验过程中发现，添加明胶溶液后，出现雾浊现象，有絮状物生成，并收缩成网状沉淀物沉淀到容器底部。从图4可以看出，明胶溶液浓度在0～0.4 g/L时，随着浓度的增加，透光率呈现上升趋势，当浓度达0.4 g/L时，透光率最大，为80.7%，浓度继续增大时透光率不再上升反而下降。可溶性固形物含量则随着明胶溶液浓度的增大呈现先下降后稳定的趋势，且下降幅度不大。
2.2.2.2 添加量的影响。
向试验样品中添加0.4 g/L明胶溶液体积分别为0、1、2、3、4、5、6 mL，常温下保持40 min，离心后分别测定上清液的透光率和可溶性固性含量，结果见图5。由图5可知，随着添加量上升，透光率呈现先上升后下降的趋势，并在添加量为3 mL时达到最大，为83.2%。可溶性固形物含量变化不明显，均在2%左右波动。
2.2.2.3 作用时间的影响。
向试验样品中投入3 mL浓度为0.4 g/L的明胶溶液，常温下作用时间分别设定为30、60、90、120、150 min，离心后分别测定上清液的透光率和可溶性固性含量，结果如图6所示。从图6可以看出，当作用时间为30～90 min时，透光率显著提高，90 min时达到最大透光率，为85.4%，作用时间继续延长，透光率出现一定程度下降，随后保持平稳。可溶性固形物含量变化微小，波动不大。
2.2.2.4 正交试验。
以明胶作为澄清剂，优化澄清工艺的正交试验结果见表8。从表8可以得出，最优组合为A3B3C2，即明胶溶液浓度为0.6 g/L，添加量为3 mL，作用时间为120 min。由极差分析可知，各因素对透光率影响主次顺序为A、B、C，即明胶溶液浓度的影响最大，其次是添加量，作用时间的影响最小。可溶性固形物含量在正交试验中差异不大，较为稳定。以透光率为指标，对正交试验结果进行方差分析。结果表明，3个因素中，仅明胶溶液浓度对透光率有显著性影响（Sig.=0.03<0.05），添加量（Sig.=0.26）、作用时间（Sig.=0.53）的影响则不显著。
2.2.2.5 验证试验。以正交试验得到的最优组合进行验证试验。试验所得透光率为91.2%，可溶性固形物含量为1.8%，与正交试验表中第9组试验的结果不存在显著性差异，且均高于其他8组试验的结果。这表明正交试验结果较为稳定，最优组合正确。
3 结论与讨论
微量元素是人体必需的营养成分，也是巨峰葡萄汁保健功能的重要因素之一。由ICP-MS技术测得巨峰葡萄汁中Fe、Cu、Mn、Zn含量较高，分别为8.810、2.340、2.200、0.943 mg/L。Fe可促进血红蛋白合成，有助于机体中氧的运输；Cu的主要功能为辅助造血，可促进血红蛋白中Fe的合成，促进Fe的吸收，是乳糖酶、酪氨酸酶、超氧化物歧化酶（SOD）重要的组成元素，参与多种代谢反应；Mn可帮助人体形成连接组织、骨骼、凝血因子和性激素，在脂质和糖类代谢、钙吸收和血糖调控中也扮演着十分重要的角色；Zn参与人体中蛋白质、糖类、脂质和能量的代谢，有助于保持人体皮肤健康，对生长发育、提高人体免疫力、抵御疾病具有非常重要的意義。巨峰葡萄汁可帮助人体补充必需的微量元素，尤其是Fe、Cu、Mn和Zn等的良好来源。
结合单因素和正交试验，得到最优澄清工艺为果胶酶用量0.01 g/L、酶解温度40 ℃、酶解时间60 min，透光率为88.1%，可溶性固形物含量为2.4%；或明胶溶液浓度0.6 g/L、添加量3 mL、作用时间120 min，透光率为91.2%，可溶性固形物含量为1.8%。明胶是一种亲水性胶体，可吸附葡萄汁中导致浑浊的酚类物质、金属离子和可溶性蛋白质等，从而发生絮凝反应，沉淀下来，以提高澄清效果。果胶酶与明胶均为良好的澄清剂，既可提高澄清度又可维持可溶性固形物含量，对样品性质影响不大，结合单因素试验和正交试验优化得到澄清工艺简单、高效、安全、可行，该参数可在巨峰葡萄汁工业化生产中应用。果胶酶和明胶的交联作用及生产应用推广将成为下一步研究的重点。
参考文献
[1]杨晓帆，高媛，韩梅梅，等.云南高原区酿酒葡萄果实香气物质的积累规律[J].中国农业科学， 2014，47（12）：2405-2416.
[2] 刘崇怀，姜建福，樊秀彩，等.中国野生葡萄资源在生产和育种中利用的概况[J].植物遗传资源学报，2014，15（4）：720-727.
[3] 黄江流，韦令，覃祖猛，等.广西中部巨峰葡萄栽培气候适宜度及其一年两收栽培技术要点[J].南方农业学报，2011，42（7）：774-778.
[4] 何建军，王博，陈爱军，等.广西不同生态区域葡萄一年两收栽培区划研究[J].南方园艺，2016，27（5）：6-8.
[5] TIWARI B K， PATRAS A，BRUNTON N，et al.Effect of ultrasound processing on anthocyanins and color of red grape juice[J].Ultrasonics sonochemistry，2010，17（3）：598-604. [6] CASTILLA P，DVALOS A，TERUEL J L，et al.Comparative effects of dietary supplementation with red grape juice and vitamin E on production of superoxide by circulating neutrophil NADPH oxidase in hemodialysis patients[J]. American journal of clinical nutrition，2008，87（4）：1053-1061.
[7] BED T P，MATTOSO V，PASCOAL A C，et al.Effect of grape juice consumption and red wine in the osteoprotegerin level and systolic blood pressure in rats wistar fed high-fat diet[J].International journal of food sciences and nutrition，2016，5（3）：170-174.
[8] MAION C，DE PAULA E S，GALLIMBERTI M，et al.Comparative study of data mining techniques for the authentication of organic grape juice based on ICPMS analysis[J].Expert systems with applications，2016，49：60-73.
[9] 屈慧鸽.小麦谷朊蛋白对霞多丽葡萄汁澄清效果的研究[J].食品科学，2008，29（11）：210-212.
[10] 阿衣满古力·哈力哈拜，朱璇，热合满·艾拉.果胶酶澄清和田红葡萄汁工艺研究[J].新疆农业科学，2010，47（6）：1102-1106.
[11] MAGRO L D，HERTZ P F，FERNANDEZ-LAFUENTE R，et al.Preparation and characterization of a CombiCLEAs from pectinases and cellulases：A potential biocatalyst for grape juice clarification[J].RSC Advances，2016，32（6）：27242-27251.
[12] NADAROGLU H，ADIGUZEL G，ADIGUZEL A，et al.A thermostableendoβ（1，4）mannanase from Pediococcus acidilactici （M17）：Purification， characterization and its application in fruit juice clarification[J].European food research and technology，2017，243（2）：193-201.
[13] APONSO M，MARAPANA U，MANAWADUGE R.Process optimization of pectinase enzyme aided clarification of Israel blue （Vitis vinifera L.） grape juice[J].European journal of academic essays， 2017，4（4）：165-174.
[14] DIBLAN S，TURKYILMAZ M，OZKAN M.Effects of various clarification agents on the anthocyanins and color of red grape juice from Kalecik Karasi grapes （Vitis vinifera L）[J].Food processing and technology，2015，6（8）：104-108.
[15] CAC.Codesgeneral standard for fruit juices and nectars：Codex Stan 247—2005[S].CAC，2005.
[16] 中華人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品中多元素的测定：GB 5009.268—2016[S].北京：中国标准出版社，2016：1-5.